NS3蛋白对乙型脑炎病毒增殖的影响及其宿主互作蛋白的筛选

摘要

流行性乙型脑炎是由乙型脑炎病毒(JEV)引起的一种主要经蚊虫传播的人畜共患传染病，对人类健康与养猪业产生极大危害。JEV感染宿主细胞具有一个完整的复制周期，包括吸附、穿入、脱壳、合成、组装与释放。JEV非结构蛋白NS3是一个具有多种酶活性的蛋白，其在JEV感染与复制过程中发挥重要作用。乙脑病毒作为一个结构较为简单的病毒，宿主与病毒蛋白之间的相互作用被认为是乙脑病毒致病的重要机制。本研究运用RNAi技术研究JEV NS3基因的沉默对体内和体外JEV增殖的影响，并利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术筛选能与NS3蛋白互作的宿主细胞蛋白，旨在深入地了解NS3蛋白对JEV增殖的影响及其具体作用机制。本研究不仅为阐明乙脑病毒增殖机理提供重要理论依据，还为抗病毒药物靶点的研究开辟新的方向。
　　1、NS3蛋白对乙型脑炎病毒增殖影响的研究
　　设计了4个乙型脑炎病毒NS3基因的RNAi靶位点，分别位于JEV基因组4656-4676、4827-4847、4916-4936与5361-5381位，将其插入表达载体pGPU6/GFP/Neo中，构建了能够将shRNA导入细胞的重组表达质粒pGP-shRNA，并证明了shRNA质粒能够特异性抑制NS3基因的表达。将shRNA表达质粒转入BHK21细胞后，间隔24h感染JEV。JEV感染细胞72h后，收集病毒培养物，运用荧光定量PCR，空斑减少实验，间接免疫荧光与Western blot检测JEV增殖量的变化。结果显示4个shRNA表达质粒对JEV的增殖均有不同程度的抑制作用。其中pGP-NS3-4质粒（基因组5361-5381）抑制效果最为显著，其使细胞中JEV mRNA的含量降低93.9％;病毒滴度下降大约950倍;间接免疫荧光结果显示细胞中乙脑病毒数量明显减少，Western blot结果显示乙脑病毒结构蛋白E蛋白含量显著降低。
　　将7日龄乳鼠分为7组，每组6只，4个pGP-shRNA质粒分别每只脑内接种2μg，接种24h后以10×LD50的剂量进行脑内攻毒，攻毒5d后，取鼠脑制成10％组织悬液，应用空斑减少实验测定病毒滴度。结果显示4个shRNA质粒均使乳鼠脑组织中JEV的病毒滴度显著降低，其中pGP-NS3-4质粒（基因组5361-5381）效果最佳，使毒价下降大约2400倍。又将pGP-NS3-4质粒接种3周龄小鼠，间隔24h以不同剂量攻毒，结果显示pGP-NS3-4质粒能为3周龄小鼠提供一定保护，10×LD50攻毒组保护率高达70％，50×LD50攻毒组保护率为60％。
　　本研究证明了NS3蛋白对JEV的增殖具有重要作用，同时发现了JEV基因组5361-5381位是一个高效的NS3基因沉默靶位点，针对该位点的基因沉默对JEV在体内外增殖具有显著的抑制作用。该研究为乙脑病毒NS3蛋白功能以及其作为抗乙脑病毒靶点的深入研究提供了重要支持。
　　2、乙型脑炎病毒NS3蛋白宿主细胞互作蛋白筛选
　　以JEV野毒分离株SCYA201201为模板，扩增全长NS3基因，并将其插入pGBKT7载体构建了pGBKT7-NS3诱饵质粒。随后将诱饵质粒转化入酵母菌Y2HGold，获得了诱饵酵母菌，并对诱饵酵母菌进行了包括毒性、自激活验证和蛋白表达鉴定，结果显示NS3片段的插入对诱饵酵母菌没有毒性作用，NS3基因没有自激活作用并且诱饵酵母菌能成功表达全长NS3蛋白。
　　采用Gold Yeast Two-Hybrid System系统将构建的诱饵酵母菌与人脑组织cDNA文库酵母菌进行酵母双杂交，连续在DDO/X/A和QDO/X/A营养缺失平板上筛选，经过三轮的筛选，最终获得了21个阳性克隆子。阳性克隆子经过扩大培养后，提取质粒并转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，利用文库质粒的抗性筛选出单克隆，提取质粒并进行测序分析，结果显示除了8个重复序列、4个非编码区序列和1个移码突变序列外，最终获得了8个NS3宿主互作蛋白的编码基因序列，将这些序列在NCBI上进行Blast分析，结果显示它们与Genbank中的参考序列相似性均高达99％以上。随后将这8个文库质粒转入酵母菌Y187株，构建猎物酵母菌，并将之与NS3诱饵酵母菌进行回复杂交验证，同时设立文库菌自激活对照组，结果显示8个杂交菌落均呈现阳性，自激活对照组全为阴性，回复验证成功。
　　本研究成功从人脑组织cDNA文库中筛选获得8个新的宿主互作蛋白，其分别是:腓骨蛋白FBLN5、蛋白磷酸脂酶PPP2CB、CRBN蛋白、G蛋白偶联受体GPR137B、泛素结合酶UBE2N、锌指蛋白ZNF350、热激蛋白Hsp40和信号复合体蛋白COP9。这些互作蛋白的成功筛选为深入研究NS3蛋白互作网络及NS3蛋白参与JEV增殖的机制奠定了重要基础。
　　3、乙型脑炎病毒NS3蛋白与宿主细胞蛋白相互作用的验证
　　本研究运用了免疫共沉淀技术验证宿主互作蛋白与乙脑病毒NS3蛋白的相互作用。首先提取人肾上皮细胞（293细胞）的总RNA并反转录成cDNA，以该cDNA为模板分别扩增出了8个互作蛋白的编码基因，并插入真核表达载体pCMV-HA构建了真核表达质粒。同时将乙脑NS3基因插入另一真核表达载体pEGFP构建了pEGFP-NS3真核表达质粒。将这些质粒分别转染入293细胞进行表达，Western blot结果显示乙脑病毒NS3蛋白与6个宿主互作蛋白可以成功表达。
　　将NS3真核表达质粒与互作蛋白表达质粒一对一组合，共转染入293细胞，转染后培养24h，非变性裂解细胞，收集蛋白。运用免疫磁珠法沉淀蛋白互作复合物，收集共沉淀产物，进行SDS-PAGE与Western blot检测。结果显示宿主细胞中的热激蛋白Hsp40(DNAJB6)可与乙脑病毒NS3蛋白在293细胞中发生相互结合，是乙脑病毒NS3蛋白的宿主互作蛋白。
　　本研究首次证实了热激蛋白Hsp40(DNAJB6)是乙型脑炎病毒NS3蛋白的宿主互作蛋白，该蛋白可能与乙脑病毒的增殖密切相关，本研究为NS3蛋白介导JEV增殖的分子机制的研究提供了重要支撑。

目录

声明

摘要

第一部分 文献综述

1 乙型脑炎病毒概述

1．1 JEV基因组结构

1．2 JEV蛋白结构

1．3 JEV培养特性

2 JEV感染细胞的机制

3 JEV非结构蛋白NS3结构与功能

3．1 NS3的丝氨酸蛋白酶结构域

3．2 NS3的核苷三磷酸/解旋酶结构域

3．3 NS3蛋白的辅助因子

3．4 NS3蛋白致细胞凋亡与致癌作用

3．5 NS3蛋白的抗原性

4 NS3蛋白与细胞自噬

5 NS3蛋白与病毒增殖

6 黄病毒宿主细胞互作蛋白研究

6．1 细胞表面受体

6．2 热激蛋白

6．3 其他宿主细胞互作蛋白

7 蛋白互作研究方法进展

7．1 酵母双杂交系统

7．2 免疫共沉淀技术

7．3 GST-Pull down技术

7．4 噬菌体展示技术

7．5 串联亲和纯化技术

7．6 荧光共振能量转移技术

研究目的与意义

第二部分 试验研究

第一章 NS3蛋白对乙型脑炎病毒增殖的影响

1 试验材料

2 试验方法

3 结果与分析

4 讨论

5 小结

第二章 NS3蛋白的宿主细胞互作蛋白的筛选

1 试验材料

2 试验方法

3 结果与分析

4 讨论

5 小结

第三章 NS3蛋白与宿主细胞蛋白相互作用的鉴定

1 试验材料

2 试验方法

3 结果与分析

4 讨论

5 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

致谢

附录

攻读学位期间发表的学术论文