紫茎泽兰致萨能奶山羊肝细胞周期阻滞与凋亡及凋亡通路研究

摘要

紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum)作为一种世界性入侵有毒有害杂草，可致家畜一系列中毒表现及病理变化。本试验旨在探索紫茎泽兰致萨能奶山羊肝细胞周期阻滞及肝细胞凋亡的分子机制。本试验以16只5-6月龄健康萨熊奶山羊为试验动物，随机均分成对照组及试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，分别饲喂含0％、40％、60％和80％紫茎泽兰混合日粮3个月，运用透射电镜（TEM）、DNA梯度法(DNALadder)、DNA原位末端标记技术(TUNEL)、蛋白印迹法(Western Blot)、荧光定量PCR(qRT-PCR)、流式细胞术(FCM)等实验手段，研究萨能奶山羊肝细胞周期阻滞时期与肝细胞凋亡及凋亡通路分子机理，为紫茎泽兰毒理学研究与毒草毒性作用机制提供理论依据。其研究内容如下:
　　1.不同剂量紫茎泽兰致萨能奶山羊肝细胞周期阻滞。FCM结果显示，与对照组相比，各试验组肝细胞S期细胞百分数极显著降低（P＜0.01），试验Ⅱ、Ⅲ组G0/G1期肝细胞百分数显著升高(P＜0.05，P＜0.01)，试验Ⅰ组变化不显著(P＞0.05)。各试验组PI僮随紫茎泽兰添加剂量增加而下降，且试验Ⅱ组显著降低（P＜0.05）、Ⅲ组极显著降低（P＜0.01），但试验Ⅰ组与对照组差异不显著(P＞0.05)。结果表明，紫茎泽兰能致萨能奶山羊肝细胞周期阻滞于G0/G1期。
　　2.不同剂量紫茎泽兰致萨能奶山羊肝细胞凋亡。FCM结果表明，与对照组相比，试验Ⅰ组正常细胞百分比显著降低(P＜0.05)，试验Ⅱ、Ⅲ组极显著降低(P＜0.01)。与对照组相比，试验组Ⅰ组肝细胞早、晚期凋亡率显著升高(P＜0.05)，试验Ⅱ、Ⅲ组均极显著升高（P＜0.01）。TUNEL结果显示，对照组偶见凋亡肝细胞，试验Ⅱ、Ⅲ组发现大量被FITC标记的凋亡肝细胞。统计5个视野凋亡肝细胞数发现，与对照组相比，试验Ⅰ组凋亡肝细胞百分数显著升高(P＜0.05)，试验Ⅱ、Ⅲ组极显著升高（P＜0.01）。AO/EB双染显示:对照组肝细胞胞核呈均匀绿色，细胞形态完整。试验Ⅱ、Ⅲ组肝细胞胞核呈亮绿色致密板块，部分呈橘红色固缩状，部分胞核胞膜破损且呈均匀红色。DAPI染色显示:对照组肝细胞胞核体积较大，呈均匀、微弱淡荧光，试验Ⅱ、Ⅲ组部分肝细胞染色呈高亮的荧光。DNA ladder结果显示:对照组总DNA为一整条完整条带，未出现明显DNA ladder，各试验组均捡出DNA ladder条带且表现出明显剂量效应。TEM结果显示，对照组肝细胞细胞核形态完整，染色质分布均匀，试验Ⅱ、Ⅲ组肝细胞胞核出现以染色质浓缩、聚集并且边缘化的凋亡特征。
　　3.不同剂量紫茎泽兰致萨能奶山羊肝细胞线粒体途径介导的凋亡。本试验利用ELISA、Western blot和qRT-PCR方法，对凋亡相关因子Bax、Bcl-2、Bid、Cyt c、APAF-1、PARP、Fas、FasL和Caspase-3，-8，-9在蛋白和mRNA水平上的表达进行检测，Caspase活性法检测Caspase-3，-8，-9活力。结果发现，紫茎泽兰致萨能奶山羊慢性中毒后，引起肝细胞Bax与Bcl-2在mRNA及蛋白水平上分别出现升高与下降，致Bax/Bcl-2比值下降、线粒体Cyt c释放到胞浆、激活APAF-1/Caspase-9凋亡小体形成、Caspase-3与PARP活化而造成线粒体功能紊乱。而Fas、FasL、Caspase-8、Bid未能显著激活。上述结果表明，紫茎泽兰可致肝细胞经线粒体途径介导肝细胞凋亡，而外源性凋亡途径未被激活。
　　通过给饲萨能奶山羊40％、60％和80％三个剂量紫茎泽兰发现，紫茎泽兰可致其肝细胞周期阻滞于G0/G1期，同时肝细胞凋亡的形态学检测提示紫茎泽兰致肝细胞凋亡，最后通过对凋亡通路相关因子的激活表明线粒体凋亡通路的激活，而外源性凋亡途径未被激活。

目录

声明

论文说明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1 紫茎泽兰简介

2 紫茎泽兰危害及开发利用

2．1 对畜牧业的危害

2．2 对生态的危害

2．3 紫茎泽兰的开发利用

3 紫茎泽兰有毒成分生物活性及中毒研究

3．1 紫茎泽兰主要有毒成分及其生物活性

3．2 动物紫茎泽兰中毒

4 细胞周期的研究进展

5 细胞凋亡的研究进展

5．1 细胞凋亡与坏死

5．2 细胞凋亡途径

6 本试验研究目的和意义

第二章 紫茎泽兰对萨能奶山羊肝细胞周期的影响

1 试验材料

1．1 试验动物及分组

1．2 试验饲料配比及制备

1．3 饲养管理

1．4 主要试验材料

2 试验方法

2．1 试验方法

2．2 数据处理

3 试验结果

3．1 肝细胞周期的变化

4 分析与讨论

5 小结

第三章 紫茎泽兰对萨能奶山羊肝细胞凋亡的影响

1 试验材料

1．1 试验动物与分组

1．2 试验主要仪器与试剂

2 试验方法

2．1 肝细胞凋亡DNA ladder检测

2．2 TUNEL检测肝细胞凋亡

2．3 肝细胞AO／EB及DAPI染色

2．4 流式细胞检测肝细胞凋亡

2．5 肝组织TEM观察

2．6 数据处理

3 试验结果

3．1 DNA ladder检测肝细胞凋亡

3．2 TUNEL检测结果

3．3 AO／EB与DAPI染色检测肝细胞凋亡变化

3．4 FCM检测肝细胞凋亡

3．5 TEM结果

4 分析与讨论

5 小结

第四章 紫茎泽兰对萨畿奶山羊肝细胞凋亡通路影响

1 试验材料

1．1 试验动物与分组

1．2 试验仪器与试剂

2 试验方法

2．1 肝细胞Caspases活性检测

2．2 qRT-PCR检测凋亡基因表达

2．3 酶联免疫吸附法(ELISA)检测凋亡蛋白

2．4 Western-blot检测凋亡蛋白表达

2．5 数据处理

3 试验结果

3．1 肝细胞Caspase-3，-8，-9活力检测结果

3．2 肝细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3，-8，-9 mRNA表达水平

3．3 ELISA检测Bax、Bcl-2、Caspase-3，-8，-9蛋白表达水平

3．4 Western blot检测肝细胞凋亡相关蛋白的表达

4 分析与讨论

4．1 线粒体凋亡途径的影响

4．2 外源性凋亡途径的影响

5 小结

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文