四川地区中华蟾蜍种群遗传多样性及高原适应研究

摘要

中华蟾蜍（Bufo gargarizans）作为我国分布较广的两栖动物之一，在国内除少数地区外都有其种群的栖息地，下至海拔120多米的田间屋后，上至海拔4300多米的高原草地都能见到其行动缓慢的身影。国内外的专家学者关于中华蟾蜍的研究不计其数，有关该群体的分类情况、系统地位一直存在争议，如今越来越多的分子证据表明中华蟾蜍不存在亚种分化而是一个独立的物种。并且作为一个海拔跨度如此大的变温物种，受不同生境的影响，其种群之间存在着差异。能在高原如此恶劣的环境下生存的中华蟾蜍有其独特的适应性，但中华蟾蜍等两栖动物的高原适应性研究相对要少。
　　因此，本实验以线粒体DNA(mitochondrion DNA，mtDNA)为分子标记，1)利用D-loop区的部分片段(565bp)，对四川8个地区（崇州、丹巴、青川、若尔盖、上里、石棉、温江、望鱼）及陕西汉中采集的共102个中华蟾蜍样本展开研究，分析其遗传多样性、遗传距离、种群结构和物种分类地位;2）通过对采自高低两个海拔梯度的40份中华蟾蜍样品线粒体基因组中6个基因(ND1、ND2、COX1、COX2、ATP6和ATP8)的全序列的研究，比较高海拔地区（海拔2940～3440m，18个样品）和低海拔地区(海拔550m，20(22)个样品）中华蟾蜍所受的选择压力的大小，揭示其中的差异，找出中华蟾蜍高原适应的遗传学证据。本实验的主要结果及结论如下:
　　1.通过对102条中华蟾蜍D-loop区部分序列的比对分析发现:总体的碱基组成情况为T33.0％、C18.9％、A37.3％、G10.8％，碱基组成G为最小，呈现出明显的偏歧性，A+T含量达到了70.3％，远远高于G+C含量;变异（多态）位点92个，占比16.3％;可划分单倍型31个(H1～H31)，占样本总量的30.39％(31/102)，共享单倍型较少，仅占比12.90％(4/31)，并且无任何单倍型被所有种群所共有的;四川-石棉小种群的特有单倍型的比率最高，为70.00％。
　　2.9个中华蟾蜍种群都有着较高的遗传多样性，总体单倍型多样性为0.878±0.023，总体核苷酸多样性为0.04918±0.00176;相比之下，四川-望鱼小种群的遗传多样性较高，遗传资源相对更加丰富，其单倍型多样性、核苷酸多样性和平均配对差异值都是最大的，分别为0.889±0.091、0.04800±0.01137、26.833。
　　3.9个中华蟾蜍小种群的K2P遗传距离为0.000～0.096，总体平均K2P遗传距离仅为0.052;分子系统发育树分析表明，来自9个地理小种群的102个中华蟾蜍样本相互嵌合，它们并没有聚集成各自相互独立的地理分支，与其他学者的研究结果保持一致，中华蟾蜍的遗传结构与它们所处地域和海拔高度均没有关联性，支持之前关于华西蟾蜍、岷山蟾蜍和中华蟾蜍是同一个种——中华蟾蜍的这一假说。
　　4.ND1、ND2、ATP6、ATP8、COX1和COX2这6个基因的长度分别为946bp、1035bp、684bp、165bp、1542bp和688bp，与参考序列保持一致;和参考序列相比，ND1、ND2、ATP6、ATP8、COX1和COX2这6个基因分别有变异位点32个、36个、36个、3个、21个和17个，其中错义突变(missense mutation)位点分别有4个、11个、2个、1个、0个和3个。通过分析错义突变在群体中发生的频率，并经过皮尔逊卡方检验，最终发现仅有ND2基因中的A4767C和G5142A这2个突变位点与中华蟾蜍高海拔群体的高原低氧适应呈现极显著正相关关系(P＜0.01)，提示ND2基因可能是中华蟾蜍高原适应的一个候选基因。

目录

声明

摘要

中英文对照

第一章文献综述

1．1中华蟾蜍研究概述

1．1．1中华蟾蜍的生物学特征

1．1．2中华蟾蜍的地理分布

1．1．3中华蟾蜍的分类学研究

1．1．4中华蟾蜍的应用价值

1．2遗传多样性研究概述

1．3高原适应研究概述

1．4线粒体基因组(mtDNA)概述

1．5科学问题的提出

1．6研究内容和研究意义

第二章基于线粒体D-loop序列的中华蟾蜍种群遗传多样性分析

2．1材料与方法

2．1．1主要实验仪器

2．1．3样品采集

2．1．4基因组I)NA提取

2．1．5引物设计

2．1．6 DNA序列扩增与测定

2．1．7序列处理与分析

2．2结果与分析

2．2．1基因组DNA提取结果

2．2．2 DNA扩增和测序结果

2．2．3碱基组成

2．2．4序列变异

2．2．5单倍型分布

2．2．6 mtDNA D-loop遗传多样性

2．2．7中华蟾蜍各小种群之间的遗传距离

2．2．8中华蟾蜍各线粒体单倍型之间的遗传距离

2．2．9中华蟾蜍系统发育关系和单倍型网络图

2．3讨论

第三章基于线粒体PCGs序列的中华蟾蜍高原适应分析

3．1材料与方法

3．1．1主要实验仪器

3．1．2主要实验试剂

3．1．3样品采集

3．1．4基因组DNA提取

3．1．5引物设计

3．1．6 DNA序列扩增与测定

3．1．7序列处理与分析

3．2结果与分析

3．2．1基因组DNA提取结果

3．2．2 DNA扩增和测序结果

3．2．3碱基组成

3．2．4遗传多样性

3．2．5序列变异

3．2．6单倍型分布情况及其与高原适应的联系

3．2．7单倍型网络图谱

3．3讨论

第四章结论

参考文献

致谢

作者简历

附录