稻曲病菌激活水稻灌浆相关基因AGF1的时空特征研究

摘要

稻曲病是一种由真菌引起的水稻穗部病害，其唯一可见症状是水稻籽粒被稻曲病菌包裹形成稻曲球。该病害在世界范围内各大稻区的发生日趋频繁，它不仅能造成水稻产量的大幅降低，还能产生毒素影响水稻品质，危害人畜健康。近年来稻曲病已成为新的水稻三大病害之一。与此同时，稻曲病也被越来越多的学者和研究机构所关注。但目前对稻曲病的研究还不够深入，无法解释稻曲球的形成机制及稻曲病的发病机制，所以还需要我们展开大量的科学研究工作对其侵染水稻的病害机制进行深层次剖析。
　　前期研究基础为我们实验的顺利开展创造了良好的条件。我们的前期研究发现稻曲病菌侵入水稻颖花后灌浆过程受阻，子房停止发育，但有一些灌浆相关基因却被高度诱导表达，这些现象引导我们推测稻曲病菌可能模拟水稻灌浆过程，劫持水稻营养库并将营养用于自身稻曲球的形成。因此，本论文将重点关注关键灌浆基因对稻曲球形成的影响，同时对关键灌浆基因被稻曲病菌激活的时空表达特征进行详细分析。主要取得了以下进展:
　　1.使用不同稻区分离的稻曲病菌株对不同供试材料进行人工接种，统计稻曲病发病情况，筛选出不同供试材料的强致病力菌株，如JS菌株对NPB强致病，平均每穗稻曲球可达20个;PJ52和JS在ZH11上致病力较强，平均每穗稻曲球达10个以上;PJ52和HN在Dongjin上平均每穗稻曲球达20左右;而在高感品种蒲江6号(Pu6)上，五个供试菌株产生的稻曲球数量平均每穗达40-60个。该结果明确了不同菌株在不同供试材料上的致病能力，为本论文后续实验的顺利开展奠定了基础。
　　2.通过对灌浆基因突变体agf1及野生型Dongjin拷种数据的分析得出AGF1影响水稻灌浆、结实过程，其结实率下降26％，每穗实粒数减少40多粒，且agf1相对于Dongjin最明显的表型是籽粒垩白度和垩白粒率大幅增加。
　　3.将agf1和Dongjin接种稻曲病菌株PJ52和HN后统计最后平均每穗形成稻曲球的数量，结果显示PJ52在agf1上形成的稻曲球数显著低于野生型Dongjin，HN在agf1上形成的稻曲球数比Dongjin下降3倍以上，说明AGF1对稻曲球的形成起重要作用。
　　4.对AGF1启动子-报告基因材料OsAGF1pro-RFP-GUS进行GUS染色实验，结果表明AGF1被激活的时期主要是接种5d以后，9d左右最明显，激活的部位主要是在水稻颖花的浆片中。同时，利用原位杂交实验验证了这一结果。我们又对AGF1下游基因AGF2的启动子-报告基因材料OsAGF2pro-RFP-GUS进行GUS染色实验也证明该基因在接种稻曲病菌9d左右的浆片中被激活。
　　5.使用荧光标记菌株P4接种稻曲病感病水稻Pu6，通过对各个时期各花器官侵入比例的统计，发现在接种后5d左右，即稻曲病菌开始侵入到水稻内部的关键时期，稻曲病菌侵染比例最高的器官是花丝，其次是浆片，在一定程度上说明浆片在稻曲病菌的侵染过程中起着重要作用。
　　综上所述，水稻AGF1是影响稻曲球形成的关键基因，它被稻曲病菌激活的时期主要是在接种5d以后，而激活部位主要是浆片。另一方面，浆片作为响应稻曲病侵染的关键位点，它是稻曲病菌侵入前期除了花丝以外侵染比例最高的花器官，可能在稻曲病的整个侵染过程中发挥着重要作用，为后续研究提供了新的方向。本论文初步揭示了稻曲病菌侵染水稻形成稻曲球的病害新机制，对认识与防控稻曲病具有重要意义。

目录

声明

摘要

缩写表

1文献综述

1．1稻曲病研究现状

1．1．1稻曲病的发生和影响因素

1．1．2稻曲病危害

1．1．3稻曲病防治

1．1．4稻曲病菌简介

1．1．5稻曲病菌的宿主及稻曲病的病害循环

1．1．6稻曲病菌的侵染过程

1．1．7水稻与稻曲病互作研究进展

1．2．2灌浆相关基因介绍

1．3论文的选题依据及意义

2实验材料与方法

2．1实验材料

2．1．1植物材料，菌株

2．1．2主要培养基

2．1．3主要仪器设备

2．1．4主要试剂配制

2．2实验方法

2．2．1水稻材料准备

2．2．2稻曲病菌的活化与接种液制备

2．2．3人工接种稻曲病菌

2．2．4取样

2．2．5水稻DNA提取

2．2．6潮霉素浸泡叶片检测阳性植株

2．2．7 PCR鉴定突变体及转基因阳性植株

2．2．8突变体材料农艺性状统计

2．2．9稻曲球数量统计

2．2．10 GUS染色实验

2．2．11石蜡切片制作

2．2．12原位杂交实验

2．2．13荧光菌株接种后不同时期各花器官侵染比例统计

3结果与分析

3．1供试材料致病稻曲菌株筛选

3．2 agf1(Activated grain-filling-related gene 1)突变体材料的鉴定和农艺性状调查

3．3 agf1突变体与Dongjin对稻曲病敏感性差异鉴定

3．4 AGF1被稻曲病菌激活的时空表达特征

3．5原位杂交实验对AGF1被稻曲病菌激活的时空特征进行验证

3．6稻曲病菌侵染的水稻颖花中AGF1下游基因AGF2的表达特征

3．7 P4荧光菌株接种Pu6探究稻曲病菌侵染水稻颖花各组织在不同时期的侵染比例

4全文总结与讨论

参考文献

致谢