从miRNA转录组层面揭示多物种的高海拔适应性机制

摘要

为了适应高海拔地区的极端环境，高原动物进化出了一些典型的解剖学和生理学特征，包括更大的肺脏和心脏、迟钝的缺氧性肺血管收缩、更大的血流量以及更强的代谢能力。近年来，高海拔适应性机制这个有趣的生物学问题吸引了包括生理学家、遗传学家等研究人员的关注。人们在形态学、解剖学、血液学、生理学和基因组学等层面对高海拔适应性机制展开了大量研究，但少有研究关注小RNA在高海拔适应性中的作用，特别是microRNAs在高海拔适应性中的多物种比较分析。为了揭示农业动物高海拔适应的分子机制，本研究利用小RNA转录组测序手段获得了四个典型农业动物高低海拔群体的小RNA转录组数据，试图探讨四个动物在高海拔适应过程中miRNA参与机制的相似性，主要研究结果如下:
　　(1)收集了鸡、猪、牛和绵羊四个物种的高低海拔动物，每个群体三个生物学重复，采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和肌肉六个组织。对141个样本本进行了小RNA文库的构建和测序，共获得1.68Gb的原始数据，平均每个样本11.90Mb。经过过滤，每个样本平均产生11.41Mb的高质量数据;使用miRDeep2软件，在四个物种中分别鉴定了数量从323到596个不等的miRNA成熟体，以及数量从218个到394个不等的miRNA前体;此外，在四个物种中，鉴定出数量从193到304个不等的miRNA家族;
　　(2)MiRNA birth and death分析发现，鸟类和哺乳类动物的miRNA家族都发生了急剧的增加（从74个miRNA家族增加到193-304个miRNA家族不等），并且偶蹄目动物特别是反刍动物的miRNA进化速率非常快;
　　(3)通过序列相似性比较和同源位置辅助分析，对所有物种的miRNA同源基因进行了鉴定，结果表明，反刍动物内部拥有的同源miRNA基因数量最多（171个），其次为偶蹄目动物内部（111个），最后为脊椎动物内部（44个）;
　　(4)分别对单个组织的高低海拔间群体动物进行相关性分析，低海拔动物脾脏、肌肉、心脏和肝脏四个组织的相关性系数更，高海拔高动物肾脏和肺脏的相关性系数更高。这表明，人工选择和自然选择对不同组织的选择压力具有偏好性。此外，肌肉和肺脏组织的差异最显著，肌肉在低海拔动物内的相关性系数高于高海拔动物内的相关性系数，肺脏在高海拔动物内的相关性系数高于低海拔动物内的相关性系数。
　　(5)聚类和主成分分析结果表明，鸡与哺乳动物的样本具有完全不同的miRNA表达模式，哺乳动物内部的样本能够按照先组织后物种的方式分开，这些结果与mRNA层面的分析结果具有很大差异。
　　(6)通过差异表达分析，在各个物种中鉴定出不同数量的差异表达miRNA。从物种上看，从牦牛、猪、绵羊到鸡的差异表达基因miRNA数量逐渐减小;从组织上看，肾脏、肝脏和脾脏拥有更多的差异表达miRNA。在四个物种中，共鉴定出2个同时在3个物种中共同差异表达的miRNA，其中包括在三个物种中差异表达的miR-122和miR-215。此外，也鉴定出miR-499，miR-200b，miR-208b，miR-30a和miR-708等17个在两个物种中同差异表达的miRNA。这些miRNA与铁离子代谢、葡萄糖代谢和细胞凋亡等过程息息相关。
　　(7)在牦牛中鉴定到miR-2285o的特异性高表达。生物信息学分析发现，蛋白酪氨酸磷酸酶受体M（protein tyrosine phosphatase，receptor type M，PTPRM）是miR-2285o的宿主基因;克隆测序分析发现，miR-2285o前体序列上两个连锁的单核苷酸突变影响了miR-2285o-3p的生成;功能分析发现miR-2285o-3p可以通过靶向同源性磷酸酶(phosphatase and tensin homolog，PTEN)和极低密度脂蛋白受体（very low density lipoprotein receptor,VLDLR）缓解低氧引起的凋亡。
　　本研究绘制了鸡、牛、羊和猪四个典型农业物种较为全面的miRNA表达谱并分析了四个物种miRNA的进化情况，观测到miRNA和mRNA不尽相同的表达模式，各个物种均鉴定出大量参与血管生成、细胞凋亡等生物学过程的高海拔适应性相关miRNA，明确了miR-2285o表达量进化的分子机制，探明了其在高海拔适应性中的功能和作用机制。本实验的研究成果为深入挖掘农业动物的高海拔适应性分子机制提供了重要参考，为进一步开发利用我国特色遗传资源提供了重要理论依据，为发展我国高原养殖产业提供宝贵理论信息。

目录

声明

摘要

高频词对照表

第一章文献综述

1．1．2生活在高海拔环境的农业动物

1．2高海拔动物适应性的机制研究

1．2．1高原动物在形态学上的高海拔适应性

1．2．2高原动物在生理层面的高海拔适应性

1．2．3动物在基因组层面上的高海拔适应性研究

1．2．4分子水平的平行进化研究

1．3 miRNA在动物高海拔适应性中的研究进展

1．3．1 miRNA参与血管生成

1．3．2 miRNA参与红细胞生成

1．3．3 miRNA参与能量代谢

1．3．4 miRNA参与DNA损伤应答

1．3．5 miRNA参与细胞凋亡

1．4 miRNA研究的主要方法

1．4．1深度测序

1．4．2 miRNA芯片

1．4．3实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

1．4．4生物信息学分析

第二章本研究选题背景与目的意义

2．1选题背景

2．2主要研究内容

2．3研究的目的意义

第三章材料与方法

3．2．1主要仪器设备

3．2．2主要试剂

3．3试验方法

3．3．1核酸抽提和质检

3．3．2 Small RNA文库的构建、测序以及数据分析

3．3．3 Bta-miR-2285o基因多态性分析

3．3．4细胞水平功能验证

第四章结果与分析

4．1．1测序数据概述以及miRNA的鉴定

4．1．2 MiRNA的生-灭分析(Birth and death分析)

4．2主成分分析和距离矩阵分析

4．2．1 Orthologue的鉴定

4．2．2聚类分析和主成分分析

4．2．3主方差成分分析(Principal Variance Component Analysis，PVCA)

4．2．4单个组织聚类分析

4．3不同物种高低海拔群体的差异microRNA分析

4．3．1不同物种高低海拔群体的差异基因鉴定

4．3．2高海拔适应性平行进化miRNA的鉴定

4．3．3差异表达miRNA的靶基因预测

4．3．4差异表达microRNA靶基因的功能富集分析

4．4牦牛、黄牛差异表达miRNA的功能验证

4．4．2 miR-2285o在牦牛和黄牛中差异表达的分子机制

4．4．3 miR-2285o-3p在高海拔适应性中的功能

第五章讨论

5．1 MiRNA的鉴定和基因组分布密度

5．2 Birth and Death分析

5．3不同物种miRNA同源基因的鉴定和表达模式分析

5．4高低海拔动物之间的miRNA转录组差异

5．5 Bta-miR-2285o在高海拔适应性中的机制探讨

第六章结论与创新点

6．2本研究创新点

参考文献

致谢

附录

作者简历