西南地区三种胁迫条件下玉米转录组分析及胁迫响应基因功能研究

摘要

植物在生长发育过程中需要抵御复杂多样的生物及非生物胁迫，如营养胁迫、重金属胁迫、真菌病害胁迫，而胁迫往往同时或接连发生，甚至存在一定的相互作用。植物在长期进化过程中建立了复杂且精密的分子调控网络以抵御这些胁迫。植物激素及重要的功能蛋白如转录因子、转运蛋白、病程相关蛋白通常参与了植物对多种胁迫的响应过程。已有研究发现，植物响应胁迫的机制存在一定的交叉，这种交叉可能导致协同和拮抗两种结果。因此，比较研究不同胁迫条件下玉米响应的分子机制，进一步解析这些响应机制之间的差异及相互作用，有利于解析玉米响应胁迫因子的分子调控网络，最终为玉米遗传改良提供参考。玉米作为我国第一大粮食作物，在保障粮食安全、促进经济发展过程中具有重要作用。西南地区是中国第三大玉米主产区，其独特的地理和气候环境导致玉米在生长发育过程中受到多种生物及非生物胁迫，严重制约西南地区玉米生产发展。本研究在课题组前期研究的基础上，对西南地区玉米生产过程中受到三种重要胁迫类型展开研究，包括低氮、重金属镉及穗粒腐病菌胁迫。利用比较转录组学策略及分子生物学手段对不同玉米材料的胁迫响应机制展开研究，构建基因表达调控网络，挖掘并鉴定重要的胁迫响应候选基因，初步揭示玉米响应上述胁迫因子的调控机制及交叉互作关系，获得具有一定应用价值的基因资源和重要功能基因，为后期培育综合性状优良的玉米品种奠定理论基础和材料基础。本研究获得主要研究结果如下:
　　1.为了揭示玉米对禾谷镰刀菌的抗性机制，在课题组前期研究基础上，本研究对人工接菌48h、72h和96h后的抗玉米穗粒腐病材料IBM_81和感病材料IBM_85的花丝组织进行取样测序，鉴定差异表达基因。在6个比较组中共检测到5760个差异表达基因。其中仅有6个共表达差异基因，功能注释结果显示这些差异基因与防御响应相关。其中，位于基因间隔区的一个长非编码RNA(lincRNA)在病菌胁迫后显著上调表达，可能参与了玉米对禾谷镰刀菌的胁迫响应。差异表达基因功能富集分析结果表明差异表达基因在防御响应、植物激素信号转导、植物与病菌互作、苯丙烷合成通路中显著富集。在感病材料IBM_85中，光合作用相关的基因在72h表达受到病菌胁迫的抑制，而这种抑制作用在抗病材料IBM_81中96h才出现。对植物信号转导通路分析发现，JA应答通路负向调控因子ZmJAZs在抗、感材料中表达差异显著。抗病材料中ZmJAZs成员表达量较低，利于激活JA应答通路，提高植株抗性。另有ZmOPR1、ZmOPR2和ZmOPR5也参与了玉米对禾谷镰刀菌的胁迫响应。
　　2.病程相关蛋白PR1家族成员在丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路、植物激素信号通路和植物与病原菌互作中均具有重要作用。本研究在玉米中共鉴定出12个具有典型结构域的PR1基因家族成员。转录丰度变化表明4个编码PR1蛋白的基因在玉米花丝及苞叶中参与了禾谷镰刀菌胁迫响应。其中，ZmPR1-11在苞叶中大量表达，且在感病材料中具有更高的表达丰度，该基因可能具有广谱抗性。
　　3.为探究玉米抵御低氮胁迫的响应机制，本研究在不同氮素处理、不同时间点(12h、24h、48h、96h)对玉米根系突变体rtcs及野生型的根系形态和生理变化进行研究。结果表明，低氮胁迫抑制供试材料谷氨酰胺合成酶活性，降低总蛋白含量;玉米初生根长度及侧根总长在低氮胁迫下均增长，且突变体变化更为明显。上述结果表明，在低氮条件下突变体rtcs能够通过初生根延长及侧根补偿性生长弥补其种子根、茎生根缺失导致的氮素吸收缺陷。
　　4.利用比较转录组学方法对突变体rtcs与野生型在不同时间点、不同氮素水平处理下转录水平动态变化进行比较分析，共鉴定出786个与根系发育相关的共表达基因，这些基因参与了不同的生物学过程。其中mJAZ7和bHLH103在突变体中表达丰度较低，且在低氮胁迫后上调表达。共表达类群建立及顺式调控元件分析结果表明，AP2-EREBP转录因子家族成员在依赖于rtcs的调控网络中具有重要作用。本研究进一步鉴定出403个具有不同生物学功能的共表达基因参与了低氮胁迫响应。比较分析结果揭示出控制植物根系发育的调控网络影响低氮胁迫响应基因的表达。AUX/IAA-ARF-LBD-bHLH-AP2-EREBP和JAZ介导的JA应答通路调控模块在维持玉米根系发育与低氮胁迫响应之间的平衡中可能具有重要作用。
　　5.基于课题组前期研究结果，本研究采用比较转录组学的方法检测玉米自交系B73、Mo17在重金属镉胁迫下的转录水平变化，以揭示玉米响应重金属镉胁迫的基因表达调控网络。基因差异表达分析共鉴定出在不同材料、不同胁迫时间点共表达差异基因115个，主要包括胁迫响应蛋白、转运蛋白及转录因子等，如ZmNAC70、ZmRAN1、ZmJAZs和ZmOPRs。共表达网络构建共鉴定出12个共表达模块，不同共表达模块中的基因参与了不同的生物学过程。值得注意的是，部分重金属胁迫响应基因参与了其它类型的生物及非生物胁迫响应过程，如ZmJAZs及ZmOPRs。
　　6.基于转录组数据分析的结果，本研究进一步对OPR蛋白家族成员在响应镉胁迫过程中的功能进行研究。在玉米基因组中共鉴定出8个OPR家族成员。其中ZmOPR5编码OPRⅠ类蛋白，在镉胁迫下被显著诱导表达。亚细胞定位结果表明其蛋白定位于细胞膜。在镉胁迫条件下，ZmOPR5的拟南芥同源突变体atopr2的根系生长受到明显抑制，表现出镉敏感的表型。上述结果表明OPR蛋白家族成员在玉米根系响应镉胁迫过程中具有不同的生物学功能，OPRⅠ类蛋白可能具有抵御氧化胁迫、细胞解毒的功能。其中ZmOPR5可能通过其在镉胁迫响应中类似的作用机制参与禾谷镰刀菌毒素转运或者转化，降低毒素对细胞的伤害。ZmOPR2同样也具有功能多样性，参与了镉胁迫及禾谷镰刀菌响应过程，其编码的蛋白质的底物特异性决定位点氨基酸不同于ZmOPR5，表明其可能具有与ZmOPR5不同的功能。
　　7.本研究针对上述胁迫响应过程中的差异表达基因比较发现，一些重要的功能基因参与了多种胁迫响应过程。ZmJAZ7同时参与了根系发育、低氮胁迫、Cd胁迫及禾谷镰刀胁迫响应过程，其可能通过对JA应答通路的调节平衡生长发育和胁迫响应，以使植株适应多种逆境环境，保证植株正常生长发育。转录因子在调节生长发育及胁迫响应过程中具有重要作用，本研究中鉴定出多个AP2-EREBP家族成员参与了根系发育及胁迫响应。ZmOPR2和ZmOPR5通过独立于JA合成通路的途径同时参与了镉胁迫及禾谷镰刀胁迫响应，且两者对其他病菌的入侵也具有防御作用，可能具有较广的抗性。ZmPR1-2和ZmPR1-11的主要表达部位不同，分别参与了花丝和苞叶中的禾谷镰刀菌胁迫响应过程。上述结果表明玉米的生物及非生物胁迫响应调控通路存在交叉，进一步解析上述重要功能基因在多种胁迫响应过程中的功能及胁迫响应通路之间的互作，将为作物遗传改良提供更为全面的信息，利于培育优良的抗逆新品种。

目录

声明

摘要

第一章文献综述

1．1生物及非生物胁迫响应调控网络的交互作用

1．2玉米穗粒腐病及其抗病分子机制研究进展

1．2．1玉米穗粒腐病及其病原菌

1．2．2植物与病原菌的互作

1．2．3玉米穗粒腐病抗病分子机制研究

1．3植物响应氮素胁迫研究进展

1．3．1氮素及氮素吸收利用分子机制

1．3．2植物响应氮素胁迫研究进展

1．3．3玉米根系结构与氮素吸收

1．4植物响应重金属镉胁迫研究进展

1．4．1重金属镉对植物生长发育的影响

1．4．2植物镉吸收、积累的研究进展

1．4．3植物耐重金属镉胁迫的分子机制研究进展

1．5研究的目的及意义

第二章禾谷镰刀菌胁迫下玉米抗、感材料比较转录组学研究

2．1实验材料

2．1．1植物材料

2．1．2玉米穗粒腐病病原菌

2．2主要仪器及试剂

2．2．1主要仪器设备

2．2．2主要试剂

2．3培养基、营养液等配方

2．4实验方法

2．4．1玉米穗粒腐病材料处理

2．4．2 RNA-Seq材料处理及收集

2．4．3总RNA提取

2．4．4转录组测序

2．4．5生物信息学分析流程

2．4．6实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证

2．5结果与分析

2．5．2禾谷镰刀菌胁迫下玉米抗、感材料花丝组织基因表达谱分析

2．5．3 zmPR1家族全基因组挖掘及功能分析

2．6讨论

2．6．1禾谷镰刀菌胁迫下玉米花丝组织胁迫响应机制

2．6．2病程相关蛋白PR1家族成员在玉米花丝响应禾谷镶刀菌胁迫过程中的功能

第三章玉米根系响应低氮胁迫的转录比较组学分析

3．1实验材料

3．2主要仪器及试剂

3．3实验方法

3．3．1低氮胁迫样品处理

3．3．2根系形态、酶活及总蛋白测定

3．3．4 RNA提取、RNA-Seq测序及qRT-PCR

3．4结果与分析

3．4．1玉米根系突变体rtcs与正常玉米幼苗根系的表型及生理指标的差异

3．4．2玉米根系突变体rtcs及野生型根系转录组测序

3．4．3不同发育阶段玉米rtcs突变体与野生型幼苗根系基因差异表达分析

3．4．4低氮胁迫下玉米rtcs突变体与野生型幼苗根系差异表达分析

3．4．5依赖于rtcs的根系发育相关的基因调控网络在玉米根系低氮胁迫响应过程中的功能分析

3．5讨论

3．5．1玉米根系在响应低氮胁迫过程中根系形态结构、生理及转录水平的变化

3．5．2依赖于rtcs的AUX／IAA-ARF-LBD-bHLH-AP2-EREBP调控模块和JAZ介导的JA应答通路共同调控玉米根系发育及低氮胁迫响应

第四章玉米响应镉胁迫转录组分析及ZmOPR5功能分析

4．3．2 RNA-Seq测序样品取样

4．3．4 ZmOPR基因家族进化分析及ZmOPR5功能分析

4．4结果与分析

4．4．1转录组数据的质量评估及统计

4．4．2 Cd胁迫下两个材料差异表达基因鉴定及比较分析

4．4．3玉米不同基因型材料共有及特异差异表达基因功能分析

4．4．4共表达网络构建及功能分析

4．4．5 ZmOPR家族全基因组挖掘及功能分析

4．5讨论

4．5．1玉米根系响应镉胁迫过程中信号转导及响应激活

4．5．2 OPR基因家族成员在镉胁迫响应过程中的功能

第五章三种胁迫条件下玉米胁迫响应机制比较分析

5．1数据分析方法

5．2．1基于QTL定位及GWAS分析结果进行候选基因挖掘

5．2．2三种胁迫条件下玉米胁迫响应基因比较分析

5．3讨论

第六章结论

第七章今后研究计划

参考文献

致谢

附录