不同年龄段猕猴视网膜形态结构特征及DR早期对视网膜结构的影响

摘要

目的：哺乳动物出生后不同年龄段视网膜内层神经元如何改变尚无详细报道，且对早期糖尿病视网膜病变的研究较少。本文将选用猕猴作为眼科模型，研究不同年龄阶段猕猴视网膜形态结构特征，为人类眼科研究以及实验动物年龄的选择奠定基础。同时，观察糖尿病视网膜病变早期视网膜结构的变化，为糖尿病视网膜病变早期诊断、干预、阻断及治疗糖尿病视网膜病提供新思路。
　　方法：根据猕猴不同年龄将动物分为幼龄组、青年组、中年组及老年组4组，每组5只。经麻醉处死后，迅速解剖分离眼球固定保存。HE染色检测不同年龄猕猴视网膜总厚度、神经纤维层(NFL)、内网状层(IPL)及外网状层(OPL)厚度变化情况及细胞核个数变化;免疫荧光染色检测其内层神经元中的神经节细胞、杆状双极细胞、无长突细胞形态及数量的变化。
　　通过眼底彩照、OCT技术判定链脲佐菌素(streptozocin，STZ)诱导成功的Ⅰ型糖尿病猕猴（5只）、通过高脂饲料诱导的Ⅱ型糖尿病猕猴（5只）处于视网膜病变早期，同时选用对应年龄、折光度相当的猕猴分别作为对照组（5只）研究糖尿病视网膜病变。对视网膜组织行HE染色、Masson染色，然后通过免疫组织化学法、荧光定量检测血管内皮生长因子(VEGF)及色素上皮衍生因子(PEDF)的表达变化，采用免疫荧光染色检测猕猴视网膜内神经胶质细胞，视网膜内层各类神经元形态及表达量变化。
　　结果：不同年龄的猕猴视网膜呈现出典型的结构特征:幼龄时期猕猴视网膜NFL厚度与青年时期无明显变化。中年时期、老年时期猕猴视网膜NFL厚度显著(P＜0.05)大于幼龄时期及青年时期，也就是说猕猴视网膜NFL层在中年时期发育完善。视网膜总厚度、IPL、OPL厚度与NFL层厚度变化呈现完全相同的趋势。对各年龄段神经节细胞密度进行统计发现，青年时期猕猴视网膜神经节细胞密度均显著(P＜0.01)大于其他时期。对杆状双极细胞密度统计发现，青年时期的杆状双极细胞个数显著大于(P＜0.05)其他时期，且老龄动物相比中年动物杆状双极细胞数量显著（P＜0.05）减少;通过无长突细胞密度统计发现，青年时期无长突细胞密度显著(P＜0.01)大于幼龄时期和老龄时期，且老龄动物相比中年动物无长突细胞数量显著(P＜0.05)减少;水平细胞密度在青年时期相比幼龄时期、老龄时期明显(P＜0.05)较大。
　　猕猴对照组、糖尿病猕猴眼底彩照均未见明显的糖尿病视网膜病变症状，OCT筛选出了视网膜黄斑部位血管出现轻微渗出和积液的糖尿病组猕猴。HE染色提示各组猕猴视网膜各种神经细胞形态基本正常，但视网膜神经纤维层出现了变薄。Masson染色提示，与对照组相比，T1DM及T2DM猕猴糖尿病组视网膜出现的明显的胶原纤维增加，可能是由于毛细血管内皮细胞表达增多的结果。T1DM及T2DM猕猴糖尿病组与对照组相比，视网膜内VEGF在蛋白水平和mRNA水平上均有显著的增加(P＜0.05)，而PEDF在蛋白水平和mRNA水平上均有显著(P＜0.05)减少。对糖尿病猕猴视网膜GFAP及Iba-1的表达进行积分光密度值统计发现，Ⅰ型糖尿病及Ⅱ型糖尿病与相应对照组相比均有显著(P＜0.05)增加。免疫荧光技术结果显示，杆状双极细胞及水平细胞在形态上发生了变化，且两组糖尿病中杆状双极细胞密度相比其对照组出现了一定显著（P＜0.01）减少。同时，Ⅰ型糖尿病组无长突细胞及神经节细胞密度与对照组相比出现了一定显著（P＜0.05）减少，但在Ⅱ型糖尿病组中未发现显著性差异。糖尿病组猕猴中水平细胞密度其对照组相比未出现明显减少。
　　结论：猕猴视网膜在幼龄时期发育相对不成熟，内层神经元在青年时期发育已相对完善，但视网膜神经纤维层在中年时期最发达，老龄时期相比中年时期视网膜各层厚度有变化，这些变化可能与信号的传递、处理、整合相关。
　　DR早期猕猴视网膜发生了神经变性和血管损伤:视网膜内层神经元在数量及形态上均发生了一定的变化，神经胶质细胞反应性增生;VEGF、PEDF表达的改变可为早期糖尿病视网膜病变提供辅助诊断。

目录

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摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．2 视网膜各级神经元分类及功能

1．3 猕猴视网膜视觉传导

2 不同年龄对视网膜结构的影响

2．1 视网膜的发育过程

2．2 年龄对视网膜结构的影响

3 糖尿病对视网膜结构的影响

3．1 糖尿病概况

3．2 糖尿病诊断标准及指标

3．3 糖尿病视网膜病变

3．4 目前针对DR的临床治疗方案

4 猕猴作为DR动物模型的优势

5 糖尿病造模方式

6 选题意义

第二章 不同年龄段猕猴内层视网膜形态学比较研究

1 材料与方法

1．1 实验动物

1．2 主要仪器以及试剂

1．3 动物的处理

1．4 实验方法

2 结果

2．1 不同年龄阶段猕猴视网膜HE染色结果

2．2 不同年龄段猕猴视网膜内层神经元免疫荧光结果

3 讨论

4 结论

第三章 DR早期对视网膜结构的影响

1 材料与方法

1．1 实验动物

1．2 主要仪器以及试剂

1．3 模型动物的建立及处理

1．4 实验方法

2 结果

2．1 利用影像学诊断筛选猕猴处于DR早期结果

2．2 猕猴视网膜HE染色结果

2．3 猕猴视网膜Masson染色结果

2．4 猕猴视网膜中VEGF及PEDF表达结果

2．5 猕猴视网膜神经胶质细胞免疫荧光结果

2．6 猕猴视网膜内层神经元免疫荧光结果

3 讨论

3．1 猕猴糖尿病视网膜病理变化

3．2 糖尿病早期与VEGF及PEDF在视网膜上的表达

3．3 糖尿病早期与视网膜内层神经元

3．4 糖尿病早期与视网膜神经胶质细胞

4 结论

创新点

参考文献

致谢

作者简历