FGF21-脂联素分泌轴介导蛋白质营养调控卵巢原始卵泡激活

摘要

静默状态的原始卵泡是储存卵母细胞的基本单位，其数量的高低决定了动物的繁殖寿命。猪卵巢原始卵母细胞数量高达百万，然而终生排出并受孕的卵母细胞仅万分之一，营养及饲养管理不当引起原始卵泡激活不足或过度激活可能是导致母猪繁殖寿命缩短的主要原因之一。细胞内感知营养代谢的关键分子mTOR是唤醒静默状态原始卵泡的必需信号通路，但营养能否通过mTOR影响原始卵泡激活报道较少。新近无脊椎动物上的研究发现，蛋白质（而非碳水化合物和脂质）是影响动物寿命、繁殖衰老的关键营养素，而蛋白质营养能否调控卵巢mTOR信号并影响原始卵泡激活及繁殖寿命尚不清楚。肝脏表达与分泌的FGF21是反映蛋白质营养状态的关键代谢信号，可显著影响细胞内的mTOR信号，但FGF21能否参与蛋白质营养调控卵巢mTOR信号及原始卵泡激活未见报道。鉴于此，本论文首先以母猪和小鼠为模型，明确蛋白限制及过量对卵巢原始卵泡激活的影响;进一步通过卵巢体外培养、转基因小鼠模型、关键营养信号的外源干预等手段，探明蛋白质营养对卵巢原始卵泡激活的调控效应及机制。研究分为5个试验:
　　试验一，饲粮蛋白限制对后备母猪原始卵泡激活及卵母细胞质量的影响。选择40头90日龄体重33kg的LY后备母猪，分别饲喂NRC推荐的正常蛋白(NP,100％SIDLys，n=20)或蛋白限制(LP,50％SIDLys，n=20)的饲粮，结果发现:
　　(1)与NP组母猪相比，LP母猪不同时间点的血液中FGF21浓度显著上升;
　　(2)与NP组母猪相比，与对照组相比，LP组后备母猪初情日龄推迟9.9天(P=0.14)，初情体重降低8.71kg(P＜0.05)。
　　(3)日粮处理30天时分析母猪卵巢形态学，与NP组相比，LP组母猪卵巢原始卵泡比例显著增加(68.74vs80.39％，P=0.012)，初级卵泡（20.87vs15.47％，P=0.062）和次级卵泡（9.46vs3.31％，P=0.040）的比例显著降低，但不影响卵巢表面直径为1～3mm有腔卵泡的数量;日粮处理至第三情期屠宰时分析母猪卵巢形态学，NP和LP组母猪各级卵泡的比例差异不显著，且不影响卵巢表面直径为1～3mm有腔卵泡的数量，以及直径≥3mm的大卵泡的数量;
　　(4)日粮处理至第三情期时，选择NP和LP组母猪卵巢上直径≥3mm的大卵泡卵母细胞卵丘细胞复合物(COCs)进行体外培养，发现NP和LP组母猪COCs的体外卵丘扩散率、卵母细胞极体排出率影响差异不显著，说明卵母细胞质量未受到日粮处理的影响;
　　以上结果说明:(1)饲粮蛋白限制降低母猪卵巢原始卵泡的激活，但不影响卵母细胞质量;(2)血液FGF21浓度下降及卵巢mTORC1信号下调可能是饲粮蛋白限制降低卵巢原始卵泡激活的原因。
　　试验二，蛋白限制及过量对小鼠原始卵泡激活及终生繁殖力的影响。选择520只4周龄C57BL/6雌鼠为研究模型，分别饲喂蛋白限制(LP,CP8％)、正常蛋白(NP,CP20％)、蛋白过量(HP，CP50％)三种日粮，日粮处理4周、12周、24周、48周后收集卵巢(n=8～10)检测原始卵泡与生长卵泡的数量及比例、卵巢蛋白表达，并在日粮处理12周、24周、48周后每个处理组选择20只雌鼠进行配种试验，结果发现:
　　(1)蛋白限制显著提高日粮处理不同时间点的肝脏Fgf21基因表达及血液FGF21浓度，蛋白过量显著降低肝脏Fgf21基因表达及血液FGF21浓度;蛋白限制提高脂肪组织Adiponectin基因表达及血液脂联素浓度，蛋白过量显著降低脂肪组织Adiponectin基因表达及血液脂联素浓度;
　　(2)通过HE染色分析卵巢形态学，发现蛋白限制显著降低卵巢原始卵泡激活，表现在:卵巢原始卵泡数量和比例显著增加、初级卵泡数量和比例显著下降、初级卵泡与原始卵泡相对比例显著下降;相反，蛋白过量显著增加卵巢原始卵泡激活，表现在:卵巢原始卵泡数量和比例显著下降、初级卵泡数量和比例显著上升、初级卵泡与原始卵泡相对比例显著增加;此外，蛋白限制显著降低闭锁卵泡数量及比例，蛋白过量显著增加闭锁卵泡数量及比例;
　　(3)卵母细胞内Pten，Lhx8，Foxo3a是维持原始卵泡静默状态的关键基因，日粮处理4周后，蛋白限制不同程度地上调卵母细胞内Pten，Lhx8，Foxo3a的基因表达，而蛋白过量不同程度地降低了卵母细胞内Pten，Lhx8，Foxo3a的基因表达;
　　以上结果说明:(1)蛋白限制降低卵巢mTORC1信号并抑制原始卵泡激活，蛋白过量上调卵巢mTORC1信号并促进原始卵泡激活;(2)短期（12周）饲喂蛋白过量日粮不损害繁殖力，长期蛋白过量降低卵泡库并损害繁殖力。
　　试验三，蛋白质营养信号对体外培养卵巢原始卵泡激活的调控及机制。以体外培养新生小鼠卵巢为模型，考察蛋白质营养三种关键代谢信号（氨基酸、FGF21、脂联素）对体外培养卵巢原始卵泡激活的影响。
　　(1)根据试验二饲喂LP、NP、HP日粮小鼠餐后血液氨基酸组成，设计不同氨基酸水平(LP-AA:3.93mM，LP-AA:5.14mM，LP-AA:7.74mM)的培养基，考察氨基酸水平（无氨基酸、LP-AA、LP-AA、LP-AA）对体外培养卵巢原始卵泡激活及相关蛋白表达的影响，结果发现无氨基酸处理显著抑制了体外培养卵巢原始卵泡的激活，mTOR及下游靶蛋白S6的磷酸化水平显著下调，而LP-AA、LP-AA、LP-AA各处理组间卵巢原始卵泡激活、mTOR、S6蛋白磷酸化水平影响差异不显著;
　　(2)设计不同浓度的FGF21(0，50，200，1000ng/ml)处理体外培养卵巢，发现FGF21对体外培养卵巢原始卵泡激活、mTORC1信号通路关键蛋白表达影响差异不显著;
　　以上结果说明:(1)氨基酸是卵巢原始卵泡激活的必需营养素，但是当氨基酸满足原始卵泡激活的基本需求后，再增加氨基酸水平对原始卵泡的激活没有影响;(2)FGF21不能直接作用于卵巢调控原始卵泡激活;(3)脂联素能够抑制体外培养卵巢原始卵泡的激活，该过程不依赖AMPK信号。
　　试验四，肝脏FGF21在蛋白质营养调控卵巢原始卵泡激活中的作用。由于肝脏分泌FGF21的首要靶器官是脂肪组织，且研究已经证实FGF21对代谢的调控依赖脂联素的表达与分泌，因此本试验采用FGF21肝脏特异性敲除(FGF21LKO)小鼠为模型，验证蛋白质营养关键信号FGF21是否通过脂联素间接调控原始卵泡激活。选择28日龄野生型(WT)及FGF21LKO小鼠，采用2×3因子设计，对WT和FGF21LKO小鼠饲喂LP、NP、HP三种日粮，日粮处理12周后考察血液激素分泌、卵巢卵泡发育及蛋白表达，结果发现:
　　(1)蛋白限制显著增加脂肪组织Adiponectin基因表达及血液脂联素浓度，肝脏FGF21敲除后，蛋白限制组小鼠脂肪组织Adiponectin基因表达及血液脂联素浓度恢复至NP组水平;
　　(2)蛋白限制显著增加野生型小鼠卵巢原始卵泡的数量和比例，降低初级卵泡的比例，蛋白过量显著降低野生型小鼠卵巢原始卵泡的数量和比例，增加初级卵泡的数量和比例;肝脏FGF21敲除后，各处理组原始卵泡和初级卵泡的数量和比例差异不显著。
　　以上结果说明:(1)肝脏FGF21参与了蛋白质营养调控原始卵泡激活;(2)蛋白限制降低原始卵泡激活的原因，与FGF21刺激脂联素的表达与分泌有关。
　　试验五，脂联素受体激动剂AdipoRon对卵巢原始卵泡过度激活的保护效应。鉴于体外试验及动物试验均已证明脂联素参与蛋白质营养调控卵巢原始卵泡激活，本试验考察外源处理脂联素受体激动剂AdipoRon能否保护蛋白过量引起的原始卵泡过度激活。本试验分为两部分:
　　(1)首先通过体外卵巢培养试验，比较了AdipoRon与脂联素对卵巢原始卵泡激活及mTORC1信号的影响，结果发现:脂联素的处理浓度为15和30μg/ml时，显著上调了AMPK磷酸化水平，下调S6的磷酸化水平，原始卵泡的激活受到显著抑制;AdipoRon的处理浓度为25mM和50mM时，显著上调了AMPK磷酸化水平，下调S6的磷酸化水平，原始卵泡的激活受到显著抑制，说明AdipoRon与脂联素在抑制原始卵泡激活及mTORC1信号方面具有相似的调控效应;
　　(2)研究进一步采用2×3因子设计，对LP、NP、HP日粮处理的28日龄雌性小鼠，按50mg/kg·天的剂量，进行连续28天的AdipoRon灌胃处理，研究发现:未进行AdipoRon处理时，LP组小鼠原始卵泡数量和比例显著高于NP和HP组，初级卵泡比例显著低于HP组，mTORC1信号显著下调，AMPK信号显著上调;进行AdipoRon处理后，HP组小鼠原始卵泡数量和比例降低至LP组水平，且各处理组间卵巢mTOR、S6、AMPK蛋白磷酸化水平差异不显著;
　　以上结果说明:脂联素受体激动剂AdipoRon与脂联素对卵巢原始卵泡激活具有相似的调控效应，外源处理AdipoRon能够防止蛋白过量引起的原始卵泡过度激活。
　　基于试验一至试验五的结果，本论文得到以下结论:
　　(1)蛋白限制降低原始卵泡激活，蛋白过量增加原始卵泡激活;
　　(2)卵巢mTORC1信号是蛋白质营养调控原始卵泡激活的关键信号;
　　(3)蛋白限制增强肝脏FGF21分泌，蛋白过量降低肝脏FGF21分泌，FGF21通过影响脂联素的分泌间接调控卵巢mTORC1信号及原始卵泡激活。

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