副猪嗜血杆菌oxyR基因缺失株构建及oxyR基因功能研究

摘要

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，H.parasuis)引起的猪的多发性浆膜炎和关节炎。多年来，该病的流行给我国及世界养猪业带来严重的经济损失。OxyR调控蛋白属于LysR转录调节因子家族的成员，在细菌抗氧化防御系统中发挥关键作用，该调控子也被认为与多种细菌毒力因子的调控相关。至今，对H.parasuis抗氧化相关的研究报道很少，对H.parasuis中oxyR基因的研究未见报道。本研究在本实验室对H.parasuis血清11型SC1401菌株全基因组测序的基础上，构建了oxyR基因缺失株（H.parasuis SC1401ΔoxyR）和回补株(H.parasuis SC1401ΔoxyR pLS88∷oxyR)，并分析其生物学表型;通过全局性比较转录组学和蛋白组学研究分析，进一步鉴定出与H.parasuis氧化应激相关的若干重要基因和重要蛋白，为阐明oxyR在H.parasuis致病过程中的作用和抗氧化应激的分子调控机制提供了科学的依据，对该病防控手段提供了新的有价值的信息。
　　一、副猪嗜血杆菌oxyR基因缺失株的构建
　　以H.parasuis SC1401菌株为亲本株，通过融合PCR将oxyR基因上游片段(U)、Kan基因片段(K)和oxyR基因下游片段(D)融合得到片段(UKD);将UKD插入到pK18mobsacB载体中，得到重组载体UKD-pK18;利用自然转化方法将重组载体UKD-pK18转入H.parasuis SC1401菌株中，挑单菌落并经PCR和Western Blot鉴定后，获得oxyR基因缺失株(H.parasuis SC1401ΔoxyR)。对oxyR基因的完整开放阅读框(ORF)进行PCR扩增，得到完整的oxyR片段;将oxyR片段与“穿梭”质粒pLS88连接，得到回补质粒pLS88∷oxyR，并电转化到oxyR基因缺失株（H.parasuis SC1401ΔoxyR），经PCR和Western Blot鉴定，得到回补株(H.parasuis SC1401ΔoxyR pLS88∷oxyR)。
　　二、副猪嗜血杆菌似oxyR基因缺失株的生物学特性研究
　　对H.arasuis SC1401、H.parasuis SC1401ΔoxyR和H.parasuis SC1401ΔoxyR pLS88∷oxyR分别经革兰氏染色镜检，发现菌体形态差异不显著;生长曲线测得12h时H.parasuis SC1401的OD600为1.68，H.parasuis SC1401ΔoxyR的OD600为0.31，H.parasuis SC1401ΔoxyR pLS88∷oxyR的OD600为1.44，证明oxyR的缺失导致H.parasuis出现显著的生长缺陷，而当oxyR基因在H.parasuis SC1401ΔoxyR中回补成功后，该生长缺陷得到修复;氧化应激抗性实验发现，在不同的H2O2浓度作用下，H.parasuis SC1401ΔoxyR的抑菌环均大于H.parasuis SC1401和H.parasuis SC1401ΔoxyR pLS88∷oxyR，表明H.parasuis SC1401ΔoxyR对H2O2比H.parasuis SC1401更敏感;生物被膜形成实验测得H.parasuis SC1401形成生物被膜的量OD600为0.520，H.parasuis SC1401ΔoxyR形成生物被膜的量OD600为0.245，H.parasuis SC1401ΔoxyR pLS88∷oxyR形成生物被膜的量OD600为0.466，说明oxyR基因对H.parasuis生物被膜的形成具有促进作用;攻毒小鼠组织病理学分析，发现亲本株在小鼠的肺、肝、脑、脾均形成不同症状的明显病变，而oxyR基因缺失后各组织病变均明显减轻甚至无病变，说明oxyR与H.parasuis毒力相关。
　　三、副猪嗜血杆菌亲本株和oxyR基因缺失株比较转录组学研究
　　应用RNA-seq技术对H.parasuis SC1401和H.parasuis SC1401ΔoxyR进行全局性比较转录组学研究，发现H.parasuis的oxyR基因缺失后，差异表达基因(DEGs)为466个(占全基因组的20.86％)，其中，上调表达240个，下调表达226个。这些DEGs的功能主要有转录调控、DNA的复制重组和修复以及氧化应激等。对这些DEGs进行GO注释，发现主要有有机环状化合物生物合成过程、杂环生物合成过程、芳香族化合物生物合成过程和氧化还原过程。对这些DEGs进行KEGG通路分析，发现主要有次生代谢产物的生物合成、不同环境中的微生物代谢、ABC转运体和碳素代谢。这些结果表明，H.parasuis的oxyR基因的缺失，对H.parasuis具有整体性的调控作用。
　　四、副猪嗜血杆菌亲本株和oxyR基因缺失株比较蛋白组学研究
　　通过iTRAQ定量蛋白质组测序分析技术，对H.parasuis SC1401和H.parasuis SC1401ΔoxyR进行了比较蛋白组学分析，发现H.parasuis的oxyR基因缺失后，差异表达蛋白(DEPs)为45个，其中14个上调，主要有溶原化蛋白HflD、ABC转运体底物结合蛋白和DNA重组修复蛋白RecA等;31个下调，主要有ABC转运蛋白通透酶、硝酸还原酶催化亚基和铁硫簇支架蛋白IscU等。对这些DEPs进行GO富集和KEGG富集分析，发现主要与碳水化合物代谢、三羧酸循环、细胞信号转导以及细菌致病性相关。
　　以上转录组学和蛋白质组学研究结果的比较关联性分析，发现二者表达量Pearson相关系数为0.261，相关性较低。但发现有18个转录本在转录组和蛋白质组中为显著差异表达，对应的基因功能主要为碳代谢、同源重组和ABC转运体等。
　　综上，本研究首次构建出H.parasuis的oxyR基因缺失株，分别对oxyR基因缺失株和亲本株进行了一系列生物学特性实验，以及比较转录组学和比较蛋白组学等较为系统的分析，发现了较为广泛的差异表达基因和差异表达蛋白，为进一步解释H.parasuis的oxyR基因缺失后生物学特性变化的成因，以及为研究oxyR基因功能和分子调控相关的H.parasuis致病机制提供了科学的依据和有价值的信息。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 副猪嗜血杆菌病

1．1 病原学特性

1．2 流行病学

1．3 致病机制与毒力因子

2 细菌的氧化应激及基因表达调控

2．1 SoxRS调控子

2．2 oxyR调控子

研究目的与意义

技术路线

第二章 副猪嗜血杆菌oxyR缺失株的构建

1 引言

2 材料

2．1 菌株与质粒

2．2 引物

2．3 试剂与实验动物

2．4 培养基与试剂的配制

2．5 主要仪器设备

3 方法

3．2 oxyR基因的克隆表达

3．3 oxyR基因上臂、Kan片段和下臂片段的融合

3．4 UKD-pK18质粒的构建

3．5 oxyR基因缺失株的构建与筛选

3．6 回补质粒pLS88：：oxyR的构建

4 结果

4．1 oxyR基因的克隆

4．2 oxyR重组蛋白的表达和纯化

4．3 oxyR基因上臂、Kan片段和下臂片段的融合

4．4 重组自杀性质粒UKD-PK18的构建

4．5 回补质粒pLS88：：oxyR的构建

4．6 oxyR基因缺失株和回补株的筛选与鉴定

5 讨论

6 小结

第三章 副猪嗜血杆菌oxyR基因缺失株的生物学特性研究

1 引言

2 材料

2．1 试剂和培养基的配制

2．2 仪器设备

2．3 实验动物

2．4实验菌株和生长条件

3 实验方法

3．1 细菌的复壮和形态观察

3．2 生长特性比较

3．3．氧化应激抗性实验

3．4 生物被膜形成实验

3．5 组织病理学分析

4 实验结果

4．1 细菌形态

4．2 TSB培养基中的生长特性

4．3 氧化应激抗性实验

4．4 生物被膜形成实验

4．5 组织病理学分析

5 讨论

6 小结

第四章 亲本株和oxyR基因缺失株比较转录组学研究

1 引言

2 材料

2．1 菌株

2．2 仪器设备

2．3 药品和试剂

3 实验方法

3．1 细菌的复苏和菌体的收集

3．2 细菌总RNA的提取

3．2 RNA-seq

3．3 RNA-seq数据分析

3．4 Real-time PCR对RNA-seq的验证

4 结果

4．1 RNA-seq结果评估

4．2 差异表达基因的GO富集和KEGG富集

4．3 与氧化应激相关的差异表达基因

4．4 与转录调控相关的差异表达基因

4．5 与DNA复制、重组和修复相关的差异表达基因

4．6 与铁代谢相关的差异表达基因

4．7 与生物膜形成相关的差异表达基因

5 讨论

6 小结

第五章 亲本株和oxyR基因缺失株比较蛋白组学研究

1 引言

2 材料

2．1 菌株

2．2 仪器设备

3 实验方法

3．1 菌体蛋白的制备

3．3 iTRAQ数据分析

3．4 蛋白组与转录组关联分析

4 结果

4．1 亲本株与oxyR基因缺失株差异表达蛋白的筛选

4．2 差异表达蛋白的GO富集分析

4．3 差异表达蛋白的KEGG富集分析

4．4 蛋白组与转录组关联分析

5 讨论

6 小结

全文结论与创新点

1 全文结论

2 全文创新点

参考文献

致谢

作者简历

附录