三个不同填饲阶段朗德鹅肥肝转录组测序及ACAA1基因的克隆

摘要

肝脏在脂质代谢、消化、吸收、合成和分解过程中均发挥关键作用。在强饲状态下，鹅能将大量脂肪沉积在肝脏中，导致肝脂肪变性，但不损害肝脏的功能。在停止饲喂后，鹅肥肝可以恢复到正常状态。鹅肥肝的研究无论是在医学还是在畜禽分子育种上，均具有重要意义。本试验使用Roche454GS FLX测序平台对朗德鹅三个不同填饲状态下的肝脏组织进行测序，对挖掘到的ACAA1基因进行克隆测序分析，结果如下:
　　1.通过转录组测序，共获得3，824，961个原始转录本，其中正常组(NL)，填饲组(FL)和恢复组(CL)分别为1，423，917、1，153，743和1，247，301个。包括37，973个isogenes，通过BLASTX对比，发现19，752个（所有序列的52.02％）isogenes与公共数据库匹配良好。
　　2.进一步进行功能注释分析发现:具有GO注释的unigenes有3562个，具有COG注释的有1，196个，注释到KEGG通路的有285个，这些基因主要涉及脂肪酸合成、代谢、结合等途径。
　　3.基于三个文库的差异表达基因比较，鉴定出1，156个差异表达的转录本，主要涉及糖类代谢、脂质合成、代谢、分泌和储存。鉴定了多个与脂肪酸的合成和代谢相关的差异表达基因，从中筛选出6个基因:LPL、ACOX、LIPH、HADHA、ACAA1和FADS。
　　4.通过qRT-PCR检测6个基因的表达水平。结果显示除LIPH基因外，其他基因的定量结果与转录组测序数据一致，这些基因的表达均在填饲组中显著升高而在恢复组中显著下调（P＜0.05）。
　　5.利用普通PCR克隆出鹅ACAA1基因的cDNA全长序列，拼接后显示全长序列为3，352bp，其中CDS区1，323bp，3'UTR77bp，5'UTR1，952bp。
　　6.生物信息学分析发现，朗德鹅ACAA1蛋白分子量为45.0kDa，等电点为9.19。蛋白含有19种氨基酸，其中甘氨酸与丙氨酸含量最高，分别为14.3％和12.7％。
　　7.观察肝脏组织切片发现，填饲状态下，鹅肝沉积大量脂滴。在此期间检测ACAA1基因的表达水平，显示随着填饲时间的延长呈现先上升后下降的趋势，即在填饲14d表达量最高，随后急速下降。同时发现该基因在填饲组的表达均显著高于对照组（P＜0.05）。
　　综上，本试验通过转录组测序筛选出6个与脂肪生成与代谢相关的差异表达基因，并克隆出ACAA1基因的全长序列。此外，发现填饲可以显著促进鹅肝脏中ACAA1基因的表达。这为了鹅的分子育种及后续功能的研究提供理论依据。

目录

声明

摘要

符号说明

1文献综述

1．1朗德鹅简介

1．2鹅肥肝的研究现状

1．2．1鹅肥肝概述

1．2．2鹅肥肝的发展现状与趋势

1．2．3鹅肥肝形成的主要途径

1．2．4调控鹅肥肝形成的基因研究

1．3高通量测序在禽类转录组分析中的应用

1．3．1测序技术的发展

1．3．2高通量测序在家禽转录组学中的应用

1．4本研究的目的与意义

2材料与方法

2．1试验材料

2．1．1实验动物

2．1．2主要仪器

2．1．3主要试剂

2．2试验方法

2．2．1肝脏组织切片

2．2．2 RNA的提取

2．2．3 cDNA文库建立与测序

2．3转录组数据处理与分析

2．3．1序列拼接

2．3．2转录组功能注释

2．3．3差异表达分析与富集分析

2．3．4差异表达基因的验证

2．4．2 ACAA1基因CDS区的克隆

2．4．3 ACAA1基因的非编码区克隆

2．4．4生物信息学分析

2．4．5荧光定量PCR

3结果与分析

3．1转录组数据分析

3．1．1测序分析

3．1．2拼接结果

3．1．3 BLAST注释

3．1．4功能注释

3．1．5差异表达基因分析

3．1．6定量分析结果

3．2 ACAA1基因的克隆与表达分析

3．2．2 ACAA1的生物信息学分析

3．2．3朗德鹅ACAA1蛋白的同源与进化分析

3．2．4 ACAA1 mRNA不同时期的表达水平

4讨论

4．1差异表达基因的GO与KEGG分析

4．2与脂肪生成相关的差异表达基因

4．3 ACAA1基因的分析

5结论

参考文献

致谢

附录

作者简历