OsEMF2b参与调控水稻花药发育的分子机制研究

摘要

水稻是我国重要的粮食作物，其花器官既是繁殖器官，也是水稻籽粒形成的基础，花器官的发育是影响水稻产量和品质的关键。PcG(polycomb group)类基因EMBRYONIC FLOWER2b(OsEMF2b)对水稻花器官发育非常重要，其对于植物开花时间、花器官形态、种子发育以及胁迫响应的调控机制等已有相关研究，但是对于OsEMF2b参与雄性生殖器官花药和花粉发育的调控机制研究目前还没有。本研究中，我们鉴定了一个花器官发育缺陷OsEMF2b T-DNA插入的弱突变体osemf2b-4，利用半薄切片、原位杂交、亚细胞定位以及RT-qPCR等方法，研究了OsEMF2b在水稻花药发育中的生物学功能，揭示了OsEMF2b在减数分裂后的花药和花粉发育过程中起着至关重要的作用，主要研究结果如下:
　　(1)对获得的OsEMF2b基因T-DNA插入突变体osemf2b-4进行检测和共分离分析，结果显示在OsEMF2b基因的启动子区域有200bp的插入，其突变表型与T-DNA插入位点共分离，将融合有水稻ACTIN启动子（强启动子）和OsEMF2b编码序列的双元表达载体，转化突变体osemf2b-4，进行互补实验的结果显示，OsEMF2b的表达量得到成功恢复的阳性植株表现出正常的花药发育和花粉，表明突变体osemf2b-4的表型确实是由OsEMF2b基因的功能减弱引起。
　　(2)与野生型相比，突变体的株高略矮，其花器官出现不同程度的发育缺陷，花粉育性出现不同程度的降低，其中轻微缺陷分为:颖壳变小，喙状颖壳，颖壳开裂和外稃过长等，分别占比为34.5％，34.5％，13.8％和6.9％;严重缺陷类型包括双护颖3.4％，颖壳卷曲3.4％，内稃或外稃缺失2％，和叶状颖花1.4％。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测发现，OsEMF2b基因在突变体osemf2b-4的颖花和叶片中表达量显著降低。通过对突变体osemf2b-4在不同花粉发育时期的花药进行切片观察发现，突变体表现为多种类型的发育缺陷，如绒毡层膨大或延迟降解，中间层缺失等，最终造成不同程度的育性缺陷。
　　(3)原位杂交结果显示，OsEMF2b基因在减数分裂期的绒毡层和小孢子，以及在小孢子时期的绒毡层中均有高表达;水稻原生质体中亚细胞定位结果显示OsEMF2b定位于细胞核内。
　　(4)对参与花药或花粉发育的15个核定位基因在突变体osemf2b-4中进行了RT-qPCR检测，发现包括GAMYB在内的14个基因在突变体中均被上调，只有PTC1的表达量在突变体中降低，表明OsEMF2b可能通过调控这些基因的表达参与水稻花药和花粉的发育。

目录

声明

摘要

第一部分文献综述

1．植物花器官发育研究进展

1．1双子叶植物花器官发育研究进展

1．2水稻花器官发育及调控基因

1．3水稻花粉发育

1．4水稻雄性不育相关调控基因

2．多梳蛋白(PcG)研究进展

2．1多梳蛋白(PcG)的概念

2．2 PRC2复合物

2．3拟南芥EMF2的功能

2．4水稻OsEMF2b研究进展

3．本研究的目的与意义

第二部分材料与方法

1．3实验所用仪器和试剂

2．实验方法技术路线

2．1实验技术路线

2．2实验方法

第三部分结果与分析

1．2农艺性状分析

1．3花器官表型

1．4突变体花药和花粉细胞学分析

2．功能验证

2．1互补载体构建

2．2互补植株的表型及OsEMF2b表达量

3．OsEMF2b的表达模式及亚细胞定位

3．1 OsEMF2b在花药中的表达模式

3．2 OsEMF2b在水稻原生质体中的亚细胞定位

4．突变体中花药和花粉发育相关基因表达受到影响

第四部分讨论

2．OsEMF2b与相关基因的互作

参考文献

附录

致谢

作者简历