高甘油三酯血症大鼠主动脉高血凝相关新基因的筛选、鉴定和克隆

摘要

该研究在我室建立的高血凝大鼠动物模型的基础上,采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,筛选、鉴定和克隆大鼠主动脉高血凝相关新基因.首先我们用高淀粉膳食(糖占总热量80﹪)造成内源性高甘油三酯血症(HTG)的大鼠模型,并对其凝血活性和纤溶活性进行检测,发现HTG大鼠的凝血活性增加而纤溶活性降低,即血液处于高凝状态.这表明用高淀粉膳食成功建立了高血凝大鼠动物模型.抑制性消减杂交(SSH)需要0.5~2ug的mRNA,由于大鼠主动脉组织中总RNA含量低,不足以获得足够量的mRNA以合成dscDNA,因此,我们利用SMART技术从总RNA合成dscDNA.然后,利用SSH dscDNA进行抑制性消减杂交,并将消减产物与pMD18-T载体连接并转化大肠杆菌JM109,成功构建了大鼠主动脉高血凝消减文库.经鉴定该文库的消减效率高,为进一步筛选和克隆高血凝相关新基因奠定了良好的基础.所构建的消减文库扩增后包含约1000个白色克隆.根据HC002 EST(567bp)序列,设计基因特异性引物(GSP1和GSP2)和巢式引物(NGSP1和NGSP2),通过SMART RACE技术分别扩增其5'端和3'端,成功地得到了约为500bp的5'-RACE PCR产物和约为800bp的3'-RACE PCR产物.将5'-RACE和3'-RACE产物克隆并测序,测序结果与EST序列用软件Contig 1拼接成一条1275bp的完整序列,即HCR2基因的全长cDNA,在GenBank中的登录号为AY234417.该研究所构建的大鼠主动脉高血凝相关基因的消减文库,为进一步筛选高血凝相关新基因奠定了坚实的基础.HC002,HC057和HC067可能与高血凝的产生机制有关,也可能与高甘油三酯血症有关.HCR2基因全长cDNA的获得,为进一步研究该基因在心脑血管疾病发生、发展中的作用奠定了基础.

目录

前言

第一部分高血凝大鼠动物模型的建立

1材料和方法

2结果

3讨论

4结论

第二部分抑制性消减杂交dscDNA的合成

1材料和方法

2结果

3讨论

4结论

第三部分消减杂交和消减文库的构建及初步鉴定

1材料与方法

2结果

2.1tester dscDNA两端连接效率的检测

2.2抑制性PCR产物和第二次PCR产物的电泳鉴定结果

2.3消减效率的鉴定

2.4消减文库的筛选和双酶切鉴定重组质粒

2.5测序和生物信息学分析

2.6半定量PT-PCR鉴定差异表达ESTS

3讨论

4结论

第四部分大鼠主动脉高血凝相关新基因HCR2全长cDNA的克隆和组织表达研究

1材料与方法

2结果

2.15'-RACE产物鉴定结果

2.25'-RACE产物的克隆及测序

2.33'-RACE产物鉴定结果

2.43'-RACE产物的克隆及测序

2.5HCR2基因的全长cDNA及开放阅读框架的确定

2.6全长cDNA的同源性分析

2.7HCR2基因的染色体定位

2.8蛋白序列同源性和功能区的计算机分析

2.9HCR2基因在大鼠多种组织的Northern杂交结果

3讨论

4结论

参考文献:

凝血系统相关基因突变及表达异常与高血凝

摘要

1凝血系统的相关基因

2抗凝系统的相关基因

3纤溶系统的相关基因

4其它高血凝相关基因

参考文献:

致谢

个人简历

声明