不同龋敏感人群变形链球菌产酸耐酸毒力因子遗传多态性研究

摘要

龋病是危害人类口腔健康的主要疾病，是一种牙菌斑生物膜依赖性疾病。血清c型变形链球菌(Streptococcusmutans，简称S.mutans，变链菌)是牙菌斑生物膜中主要定植菌之一，也是最重要的致龋菌。变链菌的致龋作用包括菌细胞的粘附、产酸和耐酸三个环节。在牙菌斑中变链菌依靠酵解糖类生存，酵解产物有机酸特别是乳酸导致环境pH降低，引起釉质脱矿发生龋病；同时，为了适应在低pH下生存和持续产酸，菌细胞必须维持一个相对中性的胞内环境，这主要通过菌细胞的耐酸能力得以实现，即酸适应性或耐酸性，故产酸和耐酸是变链菌致龋必备的两大生理特征。乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase，简称LDH)是致龋菌合成乳酸的关键酶，而质子移位膜ATP酶(membrane-boundproton-translocatingATPase，F0F1ATPase，简称F-ATPase)是菌细胞耐酸力的最主要调节机制，因此，LDH和F-ATPase是变链菌的重要产酸耐酸因子，在龋病的发生发展中发挥重要的毒力作用。 变链菌不同菌株的致龋毒力存在差异，毒力因子的基因变异是决定这种差异的重要物质基础。变链菌多态性研究近年来受到普遍关注，诸多研究证实全菌DNA和毒力因子DNA在不同菌株之间确实存在遗传多态性。本课题组前期已对不同龋敏感人群的变链菌细胞组DNA多态性、粘附因子表面蛋白P1和葡2糖基转移酶基因多态性与细菌粘附毒力及龋病发生的关系，以及菌株多项致龋毒力进行了系列研究，在此基础上，本实验对LDH和F-ATPase的遗传多态性及其与细菌产酸耐酸能力之间的关系作系统探讨，结果发现： 1.LDH不同酶活性菌株在高龋和无龋人群的分布不同，变链菌LDH活性与龋病的发生有一定相关性，实验所用的考马斯亮蓝蛋白定量结合还原性辅酶Ⅰ氧化法适于初步定量评价酶活性和菌株筛选。LDH结构基因ldh表现MseI-RFLP基因型多态，不同基因型菌株在不同酶活性组的分布不同，提示乳酸脱氢酶基因多态性与酶活性差异相关；半定量RT—PCR发现两种基因型ldh的mRNA表达水平亦不同，B型ldh及低酶活性的菌株基因表达上调。 2.变链菌临床株F-ATPase的F0主要功能亚基c、a、b的联合基因uncEBF行ALuⅠ-RFLP和DdeⅠ-RFLP分析出现A、B、C、D四种基因型且分布不同，高耐酸性菌株中A型基因uncEBF的检出高于低耐酸力菌株，其变异位点在b亚基的编码基因段，而c、a亚基基因比较保守。A基因型uncEBF表达高于B基因型，高耐酸力菌株uncEBF表达高于低耐酸力菌株，提示变链菌不同基因型uncEBF基因的表达水平不同，表达水平高低及基因特殊位点突变可能与菌株的耐酸力相关。 3.F-ATPase的γ亚基结构基因uncG通过AluI-RFLP和BsrI-RFLP分析也出现四种基因型A、B、C、D，不同基因型uncG菌株的分布差异没有统计学意义，不同基因型序列所翻译的氨基酸其同源性达100％，提示变链菌uncG基因遗传多态性与菌株的耐酸力不相关，导致基因分型的基因点突变是沉默的(silent)。来自不同耐酸力菌株和不同基因型uncG的在mRNA水平的表达差异也没有显著性，提示基因的相对恒定表达和保守为该亚基作为恒定旋转中心以实现F-ATPase的催化作用提供了保证。 4.F-ATPase的α亚基结构基因uncA的HphⅠ-RFLP和MboⅡ-RFLP分析表现4种基因型：A、B型uncA在不同龋敏感组变链菌株的分布不同，A基因型在高龋组的检出高于无龋组，C、D型uncA在不同耐酸力菌株的分布不同，高耐酸性菌株中C型基因uncA的检出高于低耐酸力菌株；C、D型uncA的mRNA3表达水平不同，且在不同的耐酸株表达也不同，C型基因表达高。提示uncA基因多态性与菌株的耐酸力和致龋性相关，其基因转录上调可能影响F-ATPase的酸调节能力。 5.F-ATPase的β亚基结构基因uncD具有A、B两种AluI-RFLP基因型，它们在不同耐酸力菌株的分布不同，A型高耐酸株的比例较低耐酸株高，但其mRNA表达水平与B基因型没有显著性差异。引起基因分型的碱基变异区域编码的氨基酸残基不在β亚基的催化位点区域，提示突变不引起催化功能氨基酸的改变，可能参与结合氨基酸的调控；不同的耐酸株uncD的mRNA表达水平明显不同，高耐酸的菌株有β亚基基因的上调。 综上所述，变链菌产酸因子LDH和耐酸因子F-ATPase各亚基基因在基因表型和mRNA表达水平上均具有明显的遗传多态性，且基因的遗传多态性与菌株的产酸和耐酸能力密切相关，变链菌可能通过LDH和F-ATPase基因的变异及转录水平的调节上调产酸和耐酸力以适应低pH环境，进而增强菌株的致龋性。为提高耐酸力，菌细胞所作出的F-ATPase适应性调节中，γ亚基和c、a亚基基因相对保守，而b、α和β亚基则活跃上调，表现核苷酸序列和转录水平上的适应性改变。

目录

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缩略词表

前 言

第一部分不同龋敏感人群血清c型变形链球菌产酸因子乳酸脱氢酶基因遗传多态性研究

实验一血清c型变形链球菌乳酸脱氢酶活性测定

实验二血清c型变形链球菌乳酸脱氢酶基因遗传多态性研究

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

附图

第二部分不同龋敏感人群血清c型变形链球菌耐酸因子F-ATPase基因遗传多态性研究

实验三血清c型变形链球菌F-ATPase亚基cab基因遗传多态性研究

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

附图

实验四血清c型变形链球菌F-ATPase亚基γ基因遗传多态性研究

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

附图

实验五血清c型变形链球菌F-ATPase亚基α基因遗传多态性研究

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

附图

实验六血清c型变形链球菌F-ATPase亚基β基因遗传多态性研究

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

附图

全文总结

参考文献

综述一：变形链球菌乳酸脱氢酶的结构和应用研究

综述二：变形链球菌质子移位ATP酶研究进展

致谢

个人简历