甲状腺转录因子-2转基因小鼠模型建立及其对腭融合的影响

摘要

甲状腺转录因子-2(TTF-2)是由titf2/foxel基因编码，为仅含有一个外显子的基因，全长为2807bp，定位于鼠4C2。TTF-2蛋白在个体发生中的表达具有高度组织特异性和发育阶段特异性，其表达受激素和细胞因子调节控制。 TTF-2蛋白具有双向调节作用，即TTF-2蛋白的转录活化作用和转录抑制作用。TTF-2蛋白通过其叉头DNA结合域与编码甲状腺过氧化物酶(TPO)和甲状腺球蛋白(Tg)基因的启动子的特殊DNA调节序列结合，调节Tg和TPO转录；TTF-2蛋白通过羧基末端抑制结构域与甲状腺特异性基因有关的辅助因子(TTF-1、PaX-9)相互作用，特异性抑制其转录活化，是启动子特异性转录抑制子。 转基因动物是将外源基因引入基因组的基因转移技术，它主要目的是把外源DNA导入动物细胞核内改变动物遗传性状，是从四维时空观察转基因的整体效应，是将外源基因转移从细胞水平到机体水平的一大飞跃。利用转基因动物技术可以建立人类疾病相关基因的转基因动物模型，以探讨目的基因的表达调控规律。 titf-2-/-小鼠和人类titf-2基因纯合缺陷表现为腭裂及甲状腺发育不全等畸形。说明titf-2基因与腭发育有密切关系。但是，目前仍不清楚TTF-2如何控制腭突形成，为详尽观察titf-2基因活动规律和其表达产物(蛋白质)的作用，作者设想建立titf-2转基因小鼠模型“正面”研究的TTF-2的功能。 因titf-2基因仅含有一个外显子而无内含子，本研究首先采取以基因组DNA为模板用PCR方法扩增目的基因片段，从titf-2基因593位点起始密码子ATG开始至1705位点终止密码子TGA结束，目的基因片段全长为1113bp。目的基因片段插入T载体，经正反双向测序检验正确后，目的基因片段插入转基因动物专用载体pBROAD3，构建了重组表达载体pBROAD3-titf-2。经体外转染小鼠骨髓间充质细胞表达实验证实本研究构建的pBROAD3-titf-2可以在体外表达TTF-2蛋白，含有结构基因表达所需的元件，完全符合用于转基因动物的制备。随后通过显微注射法，将titf-2基因注射入小鼠受精卵雄原核，经PCR和SouthernBlotting，产生转基因阳性小鼠。 对转基因胎鼠12、13、14、15天腭突TTF-2和TGFβ3表达的检测表明：TTF-2在转基因小鼠腭突中高表达，失去了其原有的时空变化规律强烈抑制了TGFβ3的表达，导致腭裂形成。 本研究中，我们制备了titf-2转基因小鼠，该小鼠产生腭裂，进一步研究发现高表达TTF-2是通过TGFβ3产生其生物学作用的，在整体动物水平研究TTF-2蛋白对腭融合的影响。我们建立的动物模型助于鉴别TTF-2作用的靶组织、靶细胞，尤其有助于发现TTF-2作用的靶基因。

目录

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英文缩略词表

前言

第一部分腭裂相关基因甲状腺转录因子-2转基因小鼠载体的构建及体外表达

前言

材料和方法

结果

讨论

第二部分甲状腺转录因子-2转基因小鼠模型建立

前言

材料与方法

结果

讨论

第三部分TTF-2和TGF β3在C57BL/6J小鼠腭突发育过程中的表达变化

前言

材料和方法

结果

讨论

第四部分甲状腺转录因子-2转基因小鼠TTF-2蛋白对腭融合的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

全文总结

综述一 甲状腺转录因子-2生物学作用机制

综述二 转基因动物的制备力法及其应用

参考文献

简历

致谢