定常流加载系统的设计制作及流体切应力对体外培养破骨细胞的影响

摘要

细胞力学是现代生物力学发展迅速的一个科学前沿领域，是组织工程学的一个重要组成部分，它研究细胞在载荷作用下细胞膜和细胞骨架的变形、粘弹性和粘附力等力学性能，还有细胞的一系列生化反应，如mRNA表达的变化、转录因子的激活、细胞内酶水平的改变及膜受体变化等[1-5]。由于人体细胞在十几至几十微米之间，细胞膜的厚度在几个纳米至几十纳米之间，常规实验力学方法无法直接应用于细胞力学特性研究，寻求合适的细胞加载方法和细胞变形的测量手段，是细胞力学面临的首要问题。应用流体对细胞加载是研究细胞生物力学反应的重要手段，模拟体内血液和组织液，从而定量研究切应力对细胞形态和功能影响，为骨代谢及血管内皮细胞的临床研究等提供理论基础。在细胞流体力学研究领域，人们提出各种实验方法和手段，开发出许多不同类型和功能的实验装置，通过对体外培养细胞施加不同方式的流体切应力，利用各种监测手段，研究细胞对切应力的反应机理。虽然运用流室研究流体切应力对骨组织来源细胞和血管内皮细胞形态及功能影响己取得诸多进展，流动装置也得以改进，但是关于流室中OC对切应力的生物力学反应报道很少，并且经典的流室系统中存在不利于实验顺利、快速进行的结构，本研究针对以上问题作了四方面工作： (1)设计制作一套细胞流体切应力实验系统：基于传统的PPFC理论和方法，并做一些改进，设计制作一套细胞流体切应力实验系统，用于体外培养细胞的定常流切应力实验。该加力系统由下储液池、蠕动泵，上储液池及PPFC四大部分组成，各部分之间由医用硅橡胶管连接。用金属夹具和医用硅橡胶密封圈封闭流室，同时不影响流室高度的准确性。由于上储液池中央设置的溢流口及上储液池出入口之间的溢流管对入口流有缓冲作用，能保证上储液池内液面高度恒定且无颤动。本系统中上储液池内液面与流室内的细胞在同一水平面上，最大限度降低了静水压对实验的影响，从而使实验结果的成因易于分析，增加了实验结果的可比性和重复性。这个系统可用于研究OC等细胞在形态学和生理生化等方面对切应力的反应。 (2)兔OC体外培养和鉴定：将12孔弹性硅橡胶块放在载玻片上并压紧，形成以载玻片为底，硅橡胶为壁的硅橡胶-载玻片培养板，培养细胞时将其放于培养皿中。接种细胞前1hr，用纤维连接蛋白处理载玻片。采用1,25维生素D3诱导骨髓产生OC，无菌条件下取新生新西兰大白兔四肢长骨，在α-MEM培养基内将骨干纵行刨开，轻刮骨的髓腔，收集冲洗液，用筛网过滤，离心，沉淀物加全培养液悬浮，血细胞计数板计数，使悬液含细胞约1×106个/ml，接种于硅橡胶-载玻片细胞培养板，TRAP染色呈阳性反应，扫描电镜观察到这些细胞能在骨片上形成典型的骨吸收陷窝，这种OC适用于生物力学研究。 (3)研究流体切应力作用下OC内空泡面积变化情况和OC的移动性：用相差显微镜观察PPFC内OC受力过程中的情况，分别在21.2dyne/cm2、9.7dyne/cm2和1.1dyne/cm2切应力强度给OC加力，在加力开始后5min、15min、30min、60min和120min拍摄同一个OC以做图像分析。用Image-ProPlus软件[8]测量OC内空泡的面积。贴壁生长的细胞在受力过程中极少脱落，它们都会向培养基的流动方向移动，不同种类的细胞移动程度不同，相同时间内OC移动的距离明显大于其它细胞。细胞内空泡数量增多，OC内空泡面积和移动距离随受力时间的增加和切应力强度的增加而增大，体外培养于载玻片上的OC在形态学方面对流体切应力敏感。 (4)研究培养于载玻片上的破骨细胞内Ca2+的空间分布情况：应用激光扫描共聚焦显微镜和Fluo-3/AM荧光探针标记技术，测定了破骨细胞胞内游离Ca2+的分布，获得的图像在计算机内用图像分析软件分析[9]。在37℃、Fluo-3/AM终浓度为10μmol/L的条件下，破骨细胞可获得良好的标记效果，破骨细胞中部层面内Ca2+荧光信号的强度较高，同一层面内分布是不均匀的。破骨细胞的不同位置的细胞器内或其附近的Ca2+浓度不同，破骨细胞可通过Ca2+浓度的空间差异来调节其自身功能。

目录

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英文缩略词表

前言

第一部分可用于体外培养细胞的流体切应力实验系统的设计和制作

第二部分兔破骨细胞的体外培养和鉴定

第三部分流体切应力对骨髓来源破骨细胞空泡面积和移动性影响的相差显微镜观察

第四部分体外培养破骨细胞内游离钙离子分布特点的激光扫描共聚焦显微镜观察

全文总结

参考文献

综述平行平板流室的设计原理及应用

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