骨髓间充质干细胞在肝损伤模型小鼠体内向肝细胞分化

摘要

研究目的：建立体外分离培养骨髓间充质干细胞(bonemesenchymalstemcells，BMSCs)的有效方法，观察BMSCs能否在有再生需求的小鼠体内向肝细胞分化，以及BMSCs移植能否促进肝脏的再生。 方法：以含20％胎牛血清的DMEM低糖培养基，原代细胞直接贴壁培养，48小时后换液继续培养，待细胞生长铺满后(原代约8-10天，以后5-7天)消化传代，从雄性BALB/C小鼠骨髓中分离BMSCs。光学显微镜下观察细胞形态及生长特性。流式细胞仪检测新鲜分离的骨髓细胞与第五代的BMSCsCD44与CD29的表达。 BMSCs移植实验动物共50只。除Y染色体阳性对照1只为雄鼠外，其余均为雌鼠，包括Y染色体阴性对照1只，正常对照组16只，模型组16只，BMSCs移植组16只。20％戊巴比妥麻醉后打开腹腔，从肝蒂处结扎并切除中叶肝脏，移植组肝右叶注射PBS稀释的源自BALB/C雄性小鼠的BMSCs0.4×105/只，模型组肝右叶注射等体积的PBS后关闭腹腔。 术后立即观察动物进食、饮水等一般情况。术后5日及14日分别处死正常对照组、模型组与BMSCs移植组小鼠各8只。观察肝脏大体改变；心脏取血，检测肝功能；称体重与肝重，计算肝脏脏器指数；取注射肝叶与非注射肝叶，制备组织芯片，HE染色观察肝脏病理改变。 BMSCs移植受鼠分别取注射肝叶、非注射肝叶、阳性对照肝组织及阴性对照肝组织制备组织芯片，在同一张芯片上同时用原位杂交检测Y染色体和免疫荧光检测白蛋白，在另一张芯片上同时用原位杂交检测Y染色体和免疫荧光检测CKl8，在激光共聚焦显微镜同一视野下分别激发FITC与Cy3，利用Lasersharp2000软件进行图像叠加。同时，另取荧光标记的芯片在荧光显微镜同一视野下分别激发FITC与Cy3，用photoshop7.0软件进行图像叠加。 结果：原代分离的骨髓细胞含较多杂细胞，接种后80分钟已有细胞贴壁，48小时后可见贴壁细胞多数伸展为纺锤形，呈克隆状生长。传代后细胞大小均匀，形态一致，部分克隆细胞平行排列，部分克隆细胞呈旋涡状生长。 新鲜分离的小鼠骨髓细胞98.7％为CD44-CD29-，没有CD44+CD29+细胞。第五代的BMSCs有97.4％的细胞CD29阳性，其中80.8％的细胞CD44+CD29+，16.6％的细胞CD44-CD29+。 实验动物全部存活，所有动物均于术后半天内开始活动、进食及饮水。术后5日模型组与移植组体重均低于正常对照组，术后14日各组体重无显著差异。术后14日模型组肝重与脏器指数显著低于正常对照组，移植组肝重和脏器指数与正常对照组相比无显著差异。 术后5日模型组与移植组总胆红素、谷丙转氨酶与谷草转氨酶均与正常对照组相比无显著差异，总蛋白与白蛋白低于正常对照组而球蛋白高于正常对照组。术后14日模型组与移植组总胆红素、谷丙转氨酶、总蛋白与白蛋白均与正常对照组相比无显著差异，球蛋白低于正常对照组；移植组谷草转氨酶显著升高，高于模型组与正常对照组。移植组肝脏镜下偶见血管内皮细胞呈纺锤形，胞浆嗜酸性增强。 移植组小鼠在移植后5天与14天注射肝叶与非注射肝叶内均可检出大量同时表达Y染色体与白蛋白和/或表达Y染色体与CK18的阳性细胞，该细胞位于肝小叶内的肝板中。供鼠来源的肝细胞多数以单个细胞的方式分散存在，但部分细胞相互邻近，偶见结节状排列，部分细胞细胞核含两个Y染色体。 结论：1.以含20％胎牛血清的DMEM低糖培养基，原代细胞直接贴壁培养，48小时后换液继续培养，可很好地从BALB/C小鼠骨髓中分离BMSCs。 2.上述方法分离得到的BMSCs含CD44+CD29+亚群(80.8％)与CD44-CD29+亚群(16.6％)。 3.在有再生需求的小鼠，BMSCs能向肝细胞分化并参与肝小叶的形成。 4.BMSCs能在有再生需求的受鼠肝内迁移。 5.BMSCs或其来源的细胞能在受鼠体内增殖。 6.BMSCs移植的安全性有待进一步研究。

目录

声明

主要缩略名词中英文对照表

前 言

材料与方法

结 果

1BMSCs的形态观察

2BMSCs的流式鉴定

3肝部分切附小鼠的一般情况观察

4肝部分切附小鼠术后5日及14日的肝脏观察

5体重、肝重与脏器指数

6肝功能检测

7HE染色

8BMSDs向肝细胞分化的检测

讨 论

结 论

参考文献

综述：肝干细胞研究进展

1肝干细胞的来源

2肝干细胞与肝再生

3肝脏的谱系

4肝干细胞与肝癌

5肝干细胞的应用前景与展望

参考文献

在读期间完成的主要工作和论文发表情况

致谢