急性酒精性肝损伤模型肝匀浆诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

摘要

背景与目的：急性肝损伤的特征是短时间内肝细胞大量变性、坏死并伴炎性细胞浸润，其临床治疗成为棘手问题。因病毒、药物、细菌、酒精及遗传等因素引起的急慢性肝脏疾病极大危害着人们的健康。目前公认的治疗急性重症及中晚期肝病的最有效方法是肝移植，但因肝源不足、价格昂贵及移植后免疫排斥反应等因素，应用受到限制。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是来自中胚层的一群异质细胞，自我复制能力强，并具有多向分化的潜能，在适宜的条件下可以分化为成骨、软骨、脂肪细胞，甚至源于中胚层的心肌细胞、外胚层的神经细胞和内胚层的肝细胞。与胚胎干细胞相比，BMSCs因其取材方便，在适当条件下可大量扩增、低免疫排斥、无伦理学争议、花费较低等特点成为组织工程和细胞治疗的研究热点。本实验通过白酒一次性灌胃制备急性酒精性肝损伤大鼠模型，并用损伤肝脏组织匀浆培养第3代大鼠BMSCs，诱导其向肝细胞方向分化，来探讨BMSCs在病理微环境下向肝细胞分化的可行性，了解BMSCs治疗急性肝脏疾病的可能机制，为BMSCs临床应用提供理论依据。
　　方法：(1)3～4周龄健康雄性SD大鼠，在LG-DMEM(含10％胎牛血清)培养体系下，采用完全贴壁法培养大鼠股骨、胫骨骨髓液获得BMSCs，体外传代；倒置相差显微镜下每日观察BMSCs的生长情况及其形态学特点；MTT法检测第3、6代细胞并绘制生长曲线，流式细胞法检测细胞表面抗原CD34、CD29、CD105的表达。(2)400～500g健康雄性SD大鼠10只，随机分为肝损伤组及对照组，每组5只，禁食不禁水12h，肝损伤组以56°红星二锅头一次性经口灌胃10ml/kg(折合酒精4.5g/kg)，对照组给予同等量生理盐水灌胃，24h后处死大鼠，取肝脏组织进行组织学检查。(3)取正常及肝损伤组大鼠肝脏，分别按肝脏湿重0.1g加1ml低糖DMEM完全培养基的比例冰上研磨制备肝脏组织匀浆。用损伤肝匀浆诱导第3代BMSCs分化，正常肝匀浆做对照，在第0、3、7、10、14、21天用RT-PCR和western blot法检测AFP、ALB的表达。
　　结果：(1)原代细胞72首次换液后可见散在分布的长梭形细胞，之后细胞生长迅速，在第8-9天融合，传代细胞生长迅速，形态均一，呈漩涡状、鱼群状生长；生长曲线示细胞第1-2天为潜伏期，4-6天为增殖期，生长迅速，在第7-8天生长缓慢进入平台期；细胞阳性表达CD29、CD105，阴性表达CD34。(2)肝损伤组大鼠肝脏病理呈明显肝脂肪变性，对照组肝脏组织形态正常。(3)在损伤及正常肝匀浆诱导下，两组BMSCs均从长梭形逐渐向多角形改变，第14天左右细胞出现肝细胞样改变。两组细胞均在第3天检测到AFP的表达，表达量在第7天左右达到高峰后迅速下降，第14天时表达量极少；在第7天检测到ALB的表达，且随时间延长表达量逐渐增加，mRNA水平与蛋白水平表达一致。但损伤肝匀浆与正常肝匀浆诱导培养的细胞各时间点AFP和ALB的表达量无统计学差异(P>0.05)。
　　结论：(1)完全贴壁法培养骨髓液可获取骨髓间充质干细胞，得到BMSCs纯度较高，体外生长活性强，增殖旺盛。(2)禁食12h后，56°红星二锅头一次性灌胃染毒大鼠，可成功制备大鼠急性酒精性肝损伤模型。(3)急性酒精性肝损伤大鼠的肝脏组织匀浆可以诱导BMSCs向肝细胞方向分化，但诱导效果与正常肝脏组织匀浆相近。