第一鳃弓外胚间充质细胞牙向分化差异基因的初步筛选

摘要

最新的发育生物学研究证实，在颅神经嵴细胞分化形成牙颌骨器官的过程中，先后经历了颅神经嵴→第一鳃弓外胚间充质→牙颌骨外胚间充质两次关键性级联分化。本研究旨在建立Balb/c胎小鼠第一鳃弓外胚间充质细胞体外培养模型，在此基础上，进行多向诱导分化研究，鉴定其干细胞生物学特性。同时，构建第一鳃弓外胚间充质细胞牙向分化双向抑制消减文库，初步筛选、验证、分析差异表达基因，为全面揭示牙发生、发育的分子调控机制提供理论依据。 首先，精确解剖分离孕9.5天(E9.5)Balb/c胎鼠第一鳃弓，采用组织块法和改良酶消化法对其进行原代培养，利用反复贴壁和多次差异消化法对其进行纯化，通过细胞形态观察、细胞生长曲线描记、计算细胞倍增时间和特异性标记物检测对其细胞生物学特性进行研究。其次，利用端粒酶原位杂交荧光探针和Brdu摄取实验，检测第一鳃弓外胚间充质细胞的增殖和自我更新能力；取第3代细胞，更换不同的条件培养液，观察其在成脂、成内皮和矿化诱导液的刺激下，细胞形态学变化，并检测鉴定相应的特异性细胞表型标记，对细胞的可塑性进行研究。然后，在相同的培养条件下，收取第3代第一鳃弓外胚间充质细胞和E16.5下颌第一磨牙牙乳头细胞，采用抑制消减杂交技术，构建双向抑制消减文库，并对细胞的总RNA质量、双链cDNA酶切效果、接头连接率、抑制消减效率、差异基因的富集程度和载体连接效率进行全面质控分析。最后，在双向抑制消减文库中随机挑取23个白色克隆，测定其核苷酸序列，利用生物信息学数据库，对差异表达片段进行同源性分析比较，寻找已知基因和未知新基因，分析其相关功能研究进展；解剖分离E9.5、E12.5、E14.5和E16.5胎鼠的第一鳃弓、下颌突和下颌第一磨牙牙乳头，利用实时荧光定量PCR技术，定量分析部分差异表达基因在四个时段组织学水平的相对变化趋势。 研究结果表明：E9.5胎鼠额鼻突、第一鳃弓、第二鳃弓均界限清楚明确，便于准确取材，组织块法原代培养细胞的时间约7～10天，上皮细胞成分较多，改良酶消化法原代培养细胞时间约2～3天，上皮细胞成分较少，两组细胞传代后细胞形态、细胞生长曲线、群体倍增时间无明显差异，但采用改良酶消化法可以在短时间内获得数量充足、纯度较高的满足实验要求的细胞。特异性标记物CD57/HNK1、波形丝蛋白免疫细胞化学染色呈均一表达。第一鳃弓外胚间充质细胞端粒酶原位杂交胞浆呈阳性反应，BrdU孵育48小时，大部分细胞胞核呈阳性反应。第3代外胚间充质细胞在成脂诱导1周左右，细胞内可见连接成片的发亮的空泡，油红O染色阳性，证实空泡为脂滴，RT-PCR产物凝胶电泳显示，诱导后细胞出现了脂蛋白脂肪酶的表达。成内皮诱导10天左右，出现了内皮细胞特有的铺路石样形态，冯威勒不兰特因子免疫细胞化学染色呈强阳性。矿化诱导1周后，Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色呈阳性反应，碱性磷酸酶染色大部分细胞呈阳性反应，矿化诱导2周后，茜素红染色显示细胞间出现致密的、圆形不透光团块，呈片状红染。以第一鳃弓外胚间充质细胞为检测子，建立的正向抑制消减文库中共有184个白色克隆，以其为驱赶子建立的反向文库中，共有132个白色克隆，通过多层次质控分析证实，消减文库质量可靠。对23个克隆进行测序分析后发现有1个是空载体，去除重复序列，对15个差异片段进行了同源性分析，发现有11个片段与小鼠已知基因高度同源，另有4个片段为染色体序列，可能为新基因。7个差异基因的实时荧光定量PCR结果与抑制消减杂交技术所获结论完全一致，其中克隆1-3倍比变化非常明显，进一步证明了其可能是一条新基因的推断。 综上所述，本研究首次在体外建立了E9.5胎鼠第一鳃弓外胚间充质细胞培养模型，所培养第一鳃弓外胚间充质细胞具有高度的增殖活性和自我更新能力，在成脂诱导液、内皮细胞条件培养液和矿化诱导液的作用下，可定向分化为脂肪细胞、内皮细胞和成骨细胞，表明其具有多向分化潜能。采用抑制消减杂交技术，首次成功构建高质量的第一鳃弓外胚间充质细胞牙向分化的双向抑制消减文库。利用生物信息学方法，初步探讨了差异表达基因的功能，并在组织学水平进一步证实了抑制消减杂交文库的质量，为克隆新基因(克隆1-3)提供了理论依据。

目录

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英文缩略词表

前 言

实验一第一鳃弓外胚间充质间充质细胞体外培养模型的构建

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

附图

实验二第一鳃弓外胚间充质间充质细胞的干细胞特性研究

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

附图

实验三第一鳃弓外胚间充质间充质牙向分化消减文库的建立

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

附图

实验四抑制消减文库差异表达基因的初步验证分析

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

附图

全文总结

参考文献

文献综述牙齿发育分子机制的研究进展

个人简历

致谢