间充质细胞的制造方法、牙的制造方法及牙形成用间充质细胞

摘要

本发明提供一种间充质细胞的制造方法，是制造用于形成牙的间充质细胞的间充质细胞的制造方法，其包括下述步骤：在分化诱导剂的存在下培养全能性干细胞，生成含有CD44阳性且CD29阳性细胞、或CD44阳性且CD106阳性细胞的分化诱导处理后的细胞集团；从所述分化诱导处理后的细胞集团中筛选CD44阳性且CD29阳性细胞、或CD44阳性且CD106阳性细胞作为牙形成用间充质细胞。另外，提供一种牙的制造方法，其包括下述步骤：使实质上仅由间充质细胞与上皮系细胞中的任一种细胞构成的第1细胞集合体、与实质上仅由任意另一种细胞构成的第2细胞集合体在不混合的情况下密接地配置在能保持细胞的接触状态的支持载体的内部，并且上述间充质细胞含有上述牙形成用间充质细胞。

说明书

技术领域

本发明涉及用于形成牙的间充质细胞的制造方法、牙的制造方法及牙形成用间充质细胞(mesenchymal cell)。

背景技术

牙是具有最外层为牙釉质、其内层为象牙质的硬组织，进而在象牙质的内侧具有产生象牙质的牙本质细胞、进一步在中心部具有牙髓的器官，有时因龋齿或牙周病等而失去。通常，认为牙损失对性命的威胁少，所以现在主要通过义齿或种植牙来修补。但是，牙的有无严重影响外观和对食物的味觉，并且从维持健康和维持高品质生活的观点来看，对开发牙的再生技术的关注越来越高。

认为牙因胎儿期的产生过程的诱导而形成，是根据多种细胞种类构筑的功能单元，与器官和脏器相同。因此，牙并不是由成体内的造血干细胞或间充质干细胞之类干细胞产生细胞种的干细胞体系产生的。由此可知，现在，仅因再生医疗进步而移入干细胞(干细胞移入疗法)不能再生牙。

为此，近年，使用分离的牙胚细胞再构筑牙胚，通过移植该再构成牙胚进行牙再生，正以这为中心进行研究。

例如，J.Dent.Res.，2002，Vol.81(10)，pp.695-700中公开了下述内容，将从牙胚分离的上皮系细胞或间充质的牙囊细胞等细胞与生物体吸收性的载体一起移植到大鼠的腹腔内，由此再生牙样组织。

作为牙胚的再生方法，例如日本特开2004-331557号公报中记载了在纤维芽细胞增殖因子等生理活性物质的存在下培养由生物体分离的牙胚细胞。另外，日本特开2004-357567号公报中提出了将从生物体中分离的牙胚细胞与能分化上述细胞的细胞中的至少一种与含有纤维蛋白的载体一起培养的方案，此处，含有纤维蛋白的载体使用牙胚的目标形状的载体，形成具有特定形态的“牙”。

美国专利申请公开第2002/0119180号公报及美国专利申请公开第2004/0219489号公报中公开了下述方法：从6个月的猪的下颚骨中，将来自形成象牙质的牙髓的间充质细胞与含有利于形成釉质的上皮系细胞的牙胚的细胞混合物接种在使由聚乙醇酸-聚乙酸共聚物构成的生物分解性聚合物固化的载体(Scaffold)中，移植到动物体内，形成牙。此处，还记载了作为载体，使用牙胚的目标形状的载体，形成具有特有形态的“牙”。

另一方面，国际公开第2005/014070号小册子中公开了用于治疗具有骨缺损或损伤的患者的牙的再生方法。根据该方法，在聚乙醇酸丝网载体上接种例如来自牙胚的间充质细胞后，将上皮系细胞与胶原一起重叠或用上皮细胞片包裹，由此形成骨。需要说明的是，国际公开第2005/014070号小册子中，为了构筑骨的形状而使用载体。

另外，国际公开第2006/129672号小册子中公开了下述技术：将来自牙胚的上皮系细胞与间充质细胞分别制成细胞集合体后，使细胞集合体密接在胶原胶内部，边保持该状态边培养，由此制造具备牙特有的细胞配置的牙。

但是，上述技术中，为了再生牙或牙胚，从生物体中获得牙胚细胞或能分化成该细胞的细胞。由此，在使用从生物体中采集的细胞的技术中，有时能获得的细胞数不充分。另外，有时细胞的获得源有限。

另外，发挥作为组织的功能时，必须将构成组织的多种细胞配置(细胞配置)在适当的相对位置，具有作为组织的方向性。

发明内容

本发明是鉴于上述情况而得到的，提供牙形成用间充质细胞的制造方法、牙的制造方法及牙形成用间充质细胞。

本发明的第一方案提供一种间充质细胞的制造方法，其是用于形成牙的间充质细胞的制造方法，该方法包括下述步骤：在分化诱导剂的存在下培养全能性干细胞，生成含有CD44阳性且CD29阳性细胞、或CD44阳性且CD106阳性细胞的分化诱导处理后的细胞集团；从所述分化诱导处理后的细胞集团中筛选CD44阳性且CD29阳性细胞、或CD44阳性且CD106阳性细胞作为牙形成用间充质细胞。

本发明的第二方案在于提供一种牙的制造方法，所述方法包括下述步骤：使实质上仅由间充质细胞与上皮系细胞中的任一种构成的第1细胞集合体、和实质上仅由任意其它一种细胞构成的第2细胞集合体在不混合的情况下密接地配置在支持载体的内部；在所述支持载体的内部培养所述第1与第2细胞集合体，其中所述间充质细胞含有上述牙形成用间充质细胞。

本发明的第三方案是提供由全能性干细胞诱导的CD44阳性且CD29阳性、或CD44阳性且CD106阳性的牙形成用间充质细胞。

根据本发明，可以提供能有效且大量制作目标牙的间充质细胞的制造方法、及有效且大量制造牙的牙的制造方法，所述牙保持有由牙釉质及象牙质得到的特有的细胞配置。

附图说明

[图1]是示意地表示牙胚形成的概念图。

[图2A]是表示本发明实施例1的EC细胞的CD44及CD29双重染色的状况的图。

[图2B]是表示本发明实施例1的DMSO处理后第6天的细胞的CD44及CD29双重染色的状况的图。

[图2C]是本发明实施例1中的筛选得到的CD44阳性且CD29阳性细胞的CD44及CD29双重染色的状况的图。

[图3A]是概念地表示本发明实施例的、使用来自牙胚的间充质细胞与上皮系细胞的牙胚再构筑顺序的图，是表示细胞配置前的凝胶包装(gelpack)的状况的图。

[图3B]是概念地表示本发明实施例的、使用来自牙胚的间充质细胞与上皮系细胞的牙胚再构筑顺序的图，是表示将第一细胞集合体配置在凝胶包装内的状况的图。

[图3C]是概念地表示本发明的实施例的、使用来自牙胚的间充质细胞与上皮系细胞的牙胚再构筑的顺序的图，是表示将第二细胞集合体配置在凝胶包装内的状况的图。

[图3D]是概念地表示本发明实施例的、使用来自牙胚的间充质细胞与上皮系细胞的牙胚再构筑的顺序的图，是表示将配置有第一细胞集合体与第二细胞集合体的凝胶包装固化的状况的图。

[图4A]是本发明实施例4的由牙胚上皮组织与牙胚间叶细胞制作而成的牙胚的HE染色像(倍率：100倍)。

[图4B]是由本发明实施例4的由牙胚上皮组织与DMSO-EC细胞制作而成的牙胚的HE染色像(倍率：100倍)。

[图4C]是本发明实施例4的由牙胚上皮组织与DMSO-EC克隆化细胞制作而成的牙胚的HE染色像(倍率：100倍)。

[图5A]是表示本发明实施例5的、EC细胞的CD44及CD29的双重染色的状况的图。

[图5B]是表示本发明实施例5的、RA处理后第7天的细胞的CD44及CD29的双重染色的状况的图。

[图5C]是表示本发明的实施例5的、筛选得到的CD44阳性且CD29阳性细胞的CD44及CD29双重染色的状况的图。

[图6]是本发明实施例5中由通过RA处理得到的CD44阳性且CD106阳性细胞与牙胚上皮组织制作而成的牙胚的HE染色像(倍率：200倍、bar为50μm)。

[图7A]是表示本发明实施例6的、EC细胞的CD44及CD106的双重染色状况的图。

[图7B]是本发明实施例6中的RA处理后第7天的细胞的CD44及CD106的双重染色的状况的图。

[图7C]本发明实施例6中筛选得到的CD44阳性且CD106阳性细胞的CD44及CD106的双重染色的状况的图。

具体实施方式

[间充质细胞的制造方法]

本发明的间充质细胞的制造方法是制造用于形成牙的间充质细胞的方法，其包括下述步骤：在分化诱导剂的存在下培养全能性干细胞，生成含有CD44阳性且CD29阳性细胞、或CD44阳性且CD106阳性细胞的分化诱导处理后的细胞集团；从所述分化诱导处理后的细胞集团中筛选CD44阳性且CD29阳性细胞、或CD44阳性且CD106阳性细胞作为牙形成用间充质细胞。

本发明发现，分化诱导全能性干细胞而得到的CD44阳性且CD29阳性细胞、或CD44阳性且CD106阳性细胞可以用作牙形成用间充质细胞。由此，也可以从来自生物体的牙或牙胚以外的物质中得到用于制作牙所需的间充质细胞，得到用于形成牙的间充质细胞，因此可以排除使用来自生物体的牙等的必要性。结果，不需要考虑从牙胚直接采集的细胞数不充分的情况或获得场所有无限制的情况就可以容易地根据情况大量得到所需量的间充质细胞。

本发明中，所谓“牙”，是指在内侧连续地具有象牙质及在外侧连续地具有牙釉质层的组织，特别是指具有牙冠或牙根的具备方向性的组织。牙的方向性可以由牙冠或牙根的配置来特定。牙冠或牙根可以基于形状或组织染色等通过肉眼观察来确认。所谓牙冠，是指具有牙釉质与象牙质的层结构的部分，牙根不存在牙釉质层。

象牙质及牙釉质可以由本领域技术人员通过组织染色等形象且容易地特定。另外，牙釉质可以通过釉质芽细胞的存在来特定，釉质芽细胞的存在可以通过有无牙釉质蛋白来确认。另一方面，象牙质可以通过牙本质细胞的存在来特定，牙本质细胞的存在可以通过有无牙本质涎蛋白来确认。牙釉质蛋白与牙本质涎蛋白的确认可以通过该领域中周知的方法容易地实施，例如可以举出原位杂交、抗体染色等。

另外，为了形成牙，首先为了形成牙胚，可以使用本发明的间充质细胞。

本发明中，“牙胚”及“牙芽”是根据后述的发生阶段而区别得到的物质中在没有特别说明时使用的表现。所谓此时的“牙胚”，是指决定将来成为牙的牙的初始胚，是在牙的产生阶段中从通常所用的蕾状期(Bud stage)至钟状期(Bell stage)的阶段，特别是未确认作为牙的硬组织的特征即象牙质、牙釉质蓄积的组织。另外，所谓“牙芽”，是指由本发明中所用的“牙胚”的阶段过渡而来的、从开始蓄积作为牙的硬组织特征即象牙质、牙釉质的阶段开始到牙从牙肉开始萌芽发挥通常作为牙的功能前的阶段的组织。

由牙胚向牙的产生通过如图1所示的个体产生的过程中，经由蕾状期、帽状期、钟状前期及后期的各个阶段来进行。此处，在蕾状期，处于上皮系细胞包裹间充质细胞的状态，至钟状前期及钟状后期时，上皮系细胞部分形成外侧的牙釉质，间充质细胞部分在内部形成象牙质。因此，通过上皮系细胞与间充质细胞的细胞间相互作用，由牙胚形成牙。

需要说明的是，本发明中，所谓“间充质细胞”，是指来自间叶组织的细胞，所谓“上皮系细胞”，是指来自上皮组织的细胞。

另外，本发明中，所谓“牙周组织”，是指牙的主要形成外层的牙槽骨及牙根膜。牙槽骨及牙根膜可以由本领域技术人员通过组织染色等形象且容易地特定。

以下，说明本发明的牙形成用间充质细胞。

用于得到本发明的牙形成用间充质细胞的全能性干细胞是指具有能分化为至少2种以上细胞的多分化能力的细胞，可以优选使用选自由胚性癌细胞、胚性干细胞、胚性生殖干细胞构成的组中的细胞。其中，从获得容易性的观点考虑，较优选为胚性癌细胞(以下称为“EC细胞”)。能应用于本发明的EC细胞可以为来自神经、睾丸、卵巢等任一种组织的细胞。作为上述EC细胞，例如，作为来自人的EC细胞，可以举出NCR-G3细胞以及NTERA-2细胞，作为来自小鼠的EC细胞，可以举出c-1300细胞或F9细胞、LT-2细胞、OTT6050细胞、PCC4细胞、P19细胞、METT-1细胞、STT-3细胞等细胞株。上述细胞可以适当根据使用目的从来自哺乳动物的灵长类(例如人、猴等)、有蹄类(例如猪、牛、马等)、小型哺乳类的啮齿类(例如小鼠、大鼠、兔等)各种动物的细胞中选择。例如，作为来自小鼠的胚性癌细胞株，可以举出上面记载的细胞株或这些细胞株的派生克隆。

全能性干细胞的培养中可以使用通常使用的培养基。作为用于培养的培养基，可以使用通常用于培养动物细胞的培养基、例如Dulbcco’sModifed Eagle Medium(DMEM)等。上述培养基中可以添加用于促进细胞增殖的血清或添加例如FGF、EGF、PDGF等细胞增殖因子或转铁蛋白等已知的血清成分来代替血清。另外，添加血清时的浓度可以根据此时的培养状态适当变更，但通常可以为10％。细胞的培养可使用通常的培养条件，例如在37℃的温度下、在浓度为5％的CO₂的恒温箱内的培养。另外，可以适当添加链霉素等抗生素。

本发明中，通过在分化诱导剂的存在下培养全能性干细胞来进行分化诱导处理。通过该分化诱导处理，由全能性干细胞生成含有CD44阳性且CD29阳性细胞、或CD44阳性且CD106阳性细胞的细胞集团。通过诱导处理而得到的细胞集团中含有上述CD44阳性且CD29阳性细胞、或CD44阳性且CD106阳性细胞即可，也可以含有上述两种细胞。

作为上述分化诱导剂，只要是至少能由全能性干细胞分化诱导为CD44表达细胞的CD44阳性细胞诱导因子，就可以使用。作为上述CD44阳性细胞诱导因子，可以举出神经嵴细胞系诱导因子、神经嵴细胞产生相关因子、神经嵴细胞增殖促进因子。神经嵴细胞系诱导因子是可以将全能性干细胞诱导为神经嵴细胞或其派生细胞(平滑肌细胞、心肌细胞等)的因子，可以举出例如二甲基亚砜(DMSO)、Dex、cAMP、六亚甲基二乙酰胺、5’-氮杂胞苷、TGFβ、Noggin等。作为神经嵴细胞产生相关因子，可以举出视黄酸(RA)、BMP-4、BMP-7、Shh、Wnt、FGF2、内皮素-1、内皮素-3、活化素βA、PDGF、VEGF等。作为神经嵴细胞增殖促进因子，可以举出FGF2、FGF8、FGF10、BMP-2、SCF、活性型维生素D3等。神经嵴细胞系诱导因子、神经嵴细胞产生相关因子及神经嵴细胞增殖促进因子没有分别明确地区别，并且可以单独使用上述分化诱导剂或组合1种以上进行使用。其中，优选能有效生成下述本发明的目标细胞集团的DMSO及RA，上述分化诱导剂可以单独或组合使用。

上述分化诱导剂可以按照能分化诱导的浓度添加在全能性干细胞的培养基中。此处所谓能分化诱导的浓度，根据所用的分化诱导剂的种类和全能性干细胞的种类等不同而不同。

例如，为DMSO时，通常相对于培养基的容量，为0.5容量％～10容量％，从对处理的细胞的生存率及通过培养得到的目标细胞的获得效率的观点来看，优选为2.5容量％～5容量％、更优选为4容量％～5容量％的浓度。为2.5容量％以上的浓度时，可以充分诱导全能性干细胞分化，另一方面，如果为5容量％以下的浓度，则不会显著损害获得目标细胞的效率。

另外，为RA的情况下，通常在培养基中为0.1μM～10μM，从对处理的细胞的生存率及通过培养得到的目标细胞的获得效率的观点来看，可以优选为0.5μM～5μM、更优选为0.5μM～2μM的浓度。如果为0.1μM以上的浓度，则可以充分诱导全能性干细胞的分化，另一方面，如果为10μM以下的浓度，则不会显著损害获得目标细胞的效率。

对于全能性干细胞的分化诱导处理可以通过在上述分化诱导剂的存在下培养全能性干细胞来进行。分化诱导处理(培养)期间根据分化诱导剂的浓度与细胞的生长活性而不同，但通常为2小时～3天，从细胞的存活率以及目标细胞的获得效率的观点来看，可以优选为6小时～24小时。设定为6小时以上可以效率良好地得到被充分分化诱导的细胞，设定为24小时以下不会显著损害效率。

另外，为了有效引发对全能性干细胞的分化诱导，在分化诱导处理的期间与分化诱导剂的浓度之间有一定的关系。即，通常在分化诱导剂存在下的培养期间(处理时间)因分化诱导剂的浓度与分化诱导剂的种类而不同，但在特定的分化诱导剂的情况下，固定培养天数时，通常存在最适合其浓度的浓度区域。另外，缩短培养天数时，最佳浓度区域移动到高浓度侧，相反，延长培养天数时，最佳浓度区域移动到低浓度侧。考虑到上述因素，能通过调节培养天数来得到在幅度较宽的浓度区域中的分化诱导效果，同时本领域技术人员可以容易地设定能得到诱导效果的最佳浓度区域。

由上述分化诱导处理而得到的分化诱导处理后的细胞集团中生成含有CD44阳性且CD29阳性细胞、或CD44阳性且CD106阳性细胞的细胞集团。也可以含有上述两种细胞。然后，该分化诱导处理后的细胞集团被供给到筛选CD44阳性且CD29阳性细胞、或CD44阳性且CD106阳性细胞作为牙形成用间充质细胞的筛选处理中。

细胞的筛选只要是可以筛选上述本发明的间充质细胞的方法即可，可以使用任意方法。作为上述筛选方法，可以举出以基因表达蛋白、细胞表面抗原、形态等为基准的筛选，可以使用上述的一种或二种以上来筛选全能性干细胞。从筛选细胞的效率的观点来看，筛选方法优选使用以细胞表面表达为基础的细胞分选仪，为了确实地筛选间充质细胞，优选使用多个组合、特别是组合基因表达谱与细胞表达抗原的表达来使用。

本发明中筛选得到的牙形成用间充质细胞除显示CD44阳性之外，还显示CD29阳性或CD106阳性的细胞性状。已知CD44是作为透明质酸受体在细胞表面表达的膜蛋白质。另一方面，已知CD29是作为整连蛋白β1分子在细胞表面表达的膜蛋白质，分别报道有在EC细胞中表达为弱阳性，在间充质细胞中以mRNA水平来表达的情况。另外，已知CD106是作为粘连分子而已知的VCAM-1分子，通常主要作为上皮系细胞的标记使用。如果是显示上述性状的细胞，则可以在下述牙的形成中作间充质细胞使用。

本发明的牙形成用间充质细胞只要是除了CD44阳性之外，CD29及CD106中的至少一种抗原也表现为阳性的集团即可，也可以含有CD44、CD29、CD106这3种抗原均为阳性的三重阳性细胞。

本发明的牙形成用间充质细胞除了基于上述CD44、CD29及CD106的细胞表面抗原筛选之外，还可以基于其他细胞性状进行筛选。

作为其他细胞性状，可以举出其他细胞表面抗原谱或基因表达谱。作为细胞表面抗原谱，可以举出例如CD14阴性、CD34阴性、CD45阴性等，上述细胞表达抗原谱可以单独使用或组合进行使用。另外，作为基因表达谱，可以举出例如Slug表达、Wnt5a表达、Lhx8表达、BMP4表达、Pax3表达、Pax9表达、Msx1表达、Oct3/4不表达、nanog不表达、Sox9不表达、Sox5不表达等，可以单独或组合上述基因表达谱进行使用，但并不限定于此。

本发明的牙形成用间充质细胞优选除表达上述CD44、CD29、CD106之外，从牙形成性能高低出发，优选表达选自Slug基因、Pax3基因、Msx1基因及Pax9基因的组中的至少一个基因，更优选均表达Slug基因及Pax3基因，特别优选全部表达上述4个基因。

上述细胞表面抗原或基因表达谱的确认及基于此的筛选中使用识别表面抗原的各种抗体或能确认基因表达的核酸序列等。上述抗体及核酸序列均是公知的，能容易获得。另外，基于上述表面抗原或基因表达的确认与筛选可以使用通常用于该用途的方法、例如利用各种抗体进行的免疫染色、流式细胞仪、细胞分选仪、RT-PCR等。

另外，本发明的制造方法中，可以与上述筛选方法组合，使用用于制成单一的间充质细胞的克隆。作为克隆的方法，可以使用通常用于该目的的方法，例如极限稀释法、细胞分选仪、克隆等。克隆可以在用上述筛选方法进行的筛选前后的任一阶段进行，但为了效率良好地得到目标间充质细胞，优选在筛选后进行。

筛选工序中，为了效率良好地得到目标细胞数，可以在筛选工序前设置增殖工序。上述增殖工序中，使用不含有分化诱导剂的通常用于培养的培养基进行分化诱导后的细胞集团的培养。由此，可以使分化诱导得到的目标细胞增殖到规定的细胞数。结果，可以通过充分的细胞数容易地实施筛选。

上述增殖工序的期间可以基于分化诱导处理后的细胞数及细胞的状态来适当设定，但从目标细胞的浓缩效率的观点考虑，通常为3～30天，可以优选为5～10天。结果，通过在作为筛选工序对象的细胞集团中含有目标牙形成用间充质细胞，并将上述细胞集团供给到筛选工序中，从而可以有效且大量地得到本发明的牙形成用间充质细胞。

由本发明的方法得到的间充质细胞可用于形成牙。牙的形成只要使用本发明的间充质细胞即可，可以为任一种方法，最优选用于以下的本发明的牙制造方法中。

以下，说明本发明的牙的制造方法。

[牙的制造方法]

使用本发明的牙形成用间充质细胞的优选的牙制造方法包括下述工序：在使实质上仅由间充质细胞与上皮系细胞中的任一种细胞构成的第1细胞集合体、和实质上由任意另一种细胞构成的第2细胞集合体在不混合的情况下密接地配置在支持载体的内部(配置工序)；在所述支持载体的内部培养所述第1及第2细胞集合体(培养工序)，其中所述间充质细胞含有上述牙形成用间充质细胞。

本制造方法中，由于不使间充质细胞与上皮系细胞作为细胞集合体而混合在支持载体的内部，而是使其以密接的状态生长，所以可以通过紧密的接触状态，有效地重现细胞间相互作用，并且可以得到内侧为象牙质、外侧为牙釉质的具有牙所特有的细胞配置的牙。此时，由于实质上由间充质细胞构成的细胞集合体含有本发明的牙形成用间充质细胞，所以可以有效且大量地制造具有特有的细胞配置的牙。

配置工序中，使第1细胞集合体与第2细胞集合体接触地配置在支持载体的内部。

此处，第1细胞集合体及第2细胞集合体分别实质上仅由间充质细胞或仅由上皮系细胞构成。此处，实质上仅由间充质细胞构成的细胞集合体含有上述牙形成用间充质细胞。该含有牙形成用间充质细胞的细胞集合体可以根据上述制造方法的调制工序来调制，另一方面，实质上仅由上皮系细胞构成的细胞集合体可以与实质上由间充质细胞得到的细胞集合体独立地调制(第1细胞调制工序及第2细胞调制工序)。

另外，所谓“细胞集合体”是指细胞密集的状态，可以为组织的状态，也可以为由单一细胞的状态调制得到的细胞集合体(细胞凝集体)。另外，所谓“实质”，是指尽量不含有作为对象的细胞以外的细胞。因此，由上皮系细胞构成的细胞集合体可以为一部分组织或单一细胞的集合体。另外，上皮系细胞及间充质细胞可以为均由单一细胞构成的细胞集合体。

第1细胞集合体与第2细胞集合体可以均为上皮系细胞及间充质细胞，构成该细胞集合体的细胞的数量根据动物的种类、支持载体的种类、硬度及大小而不同，相对于1个细胞集合体，通常为10¹～10⁸个，可以优选为10³～10⁸个。

实质上由间充质细胞构成的细胞集团只要含有牙形成用间充质细胞即可，也可以含有其他间充质细胞。

作为上述间充质细胞以外的其他间充质细胞，可以举出来自于牙胚及牙胚以外的间充质细胞。作为来自于牙胚以外的间充质细胞，是来自生物体内的其他间充质组织的细胞，可以优选举出不含有血液细胞的骨髓细胞或间充质干细胞，更优选举出来自于口腔内间充质细胞或颚骨内部的骨髓细胞、头部神经嵴细胞的间充质细胞、能产生所述间充质细胞的间充质前体细胞或其干细胞等。

为了重现在生物体内的细胞配置、有效形成具有特有的结构及方向性的牙，用于本制造方法的上皮系细胞优选为来自牙胚，从细胞的分化阶段的不成熟性和均质性的观点考虑，优选来自蕾状期至帽状期的细胞。

另外，可以为来自牙胚以外的上皮系细胞，这可以举出来自生物体内的其他上皮系组织的细胞。可以优选举出皮肤或口腔内粘膜或牙肉的上皮系细胞，更优选皮肤或粘膜等分化的例如能生出角化或角化不全的上皮系细胞的不成熟的上皮系前体细胞、例如未角化的上皮系细胞或其干细胞等。

为了调制细胞集合体而从组织中分离各细胞时，牙胚及其他组织可以从下述各种动物的颚骨等中采集：哺乳动物的灵长类，例如人、猴等；有蹄类，例如猪、牛、马等；小型哺乳类的啮齿类，例如小鼠、大鼠、兔等。牙胚及组织的采集通常可以直接应用通常用于采集组织的条件，可以在无菌状态下取出，保存在适当的保存液中。需要说明的是，作为人的牙胚，除可以举出第3臼齿，即所谓的智齿的牙胚之外，还可以举出胎儿牙胚，但从利用自身组织的观点来看，优选使用智齿牙胚。

由组织、例如牙胚调制上述细胞时，首先，将从周围组织分离的牙胚根据形状分为牙胚间叶组织与牙胚上皮组织。此时，由于牙胚组织能在显微镜下从结构上区分，所以可以用解剖用剪刀或镊子等切断、或通过剥下等容易地分离。另外，从牙胚组织分离牙胚间叶组织及牙胚上皮组织可以根据其形状用注射针、钨针、镊子等切断，或通过剥下容易地进行。

为了从周围组织容易地分离牙胚细胞及/或从牙胚组织分离上皮组织及间叶组织，可以优选使用酶。作为用于上述用途的酶，可以举出分散酶、胶原酶、胰蛋白酶等。

构成细胞集合体的细胞可以由采集的组织中调制为单一细胞的状态。调制工序中，为了能容易地分离单一细胞，可以使用酶。作为上述酶，可以举出分散酶、胶原酶、胰蛋白酶等。此时，由上皮组织分离上皮系细胞时，优选胶原酶处理后进行胰蛋白酶处理与DNase处理。另一方面，由间叶组织分离间充质细胞时，优选同时用胶原酶与胰蛋白酶处理，最终进行DNase处理。此时进行DNase处理的原因在于，防止因酶处理导致一部分细胞受到破坏，因细胞膜溶解时释放到溶液中的DNA而发生细胞凝集，从而细胞回收量降低。

另外，为了分别得到充分的细胞数，构成细胞集合体的细胞可以在配置工序前经过预培养。细胞的培养可以直接使用通常用于培养动物细胞的温度等条件。

作为用于培养的培养基，可以使用通常用于培养动物细胞的培养基、例如Dulbcco’s Modifed Eagle Medium(DMEM)等，可以添加用于促进细胞增殖的血清，或者可以添加例如FGF、EGF、PDGF等细胞增殖因子或转铁蛋白等已知血清成分来代替血清。另外，添加血清时的浓度可以根据此时的培养状态进行适当变更，但通常可以为10容量％。细胞的培养中应用通常的培养条件，例如在37℃的温度下、在浓度为5％的CO₂的恒温箱内的培养。另外，可以适当添加链霉素等抗生素。

将预培养应用于间充质细胞中时，可以为兼具用于将上述牙形成用间充质细胞增殖的培养，也可以为筛选工序后进行的培养，或这两种培养。

另外，从不改变细胞性质的观点考虑，在间充质细胞的预培养或用于上述牙形成用间充质细胞的简单增殖的培养中，可以在不含有上述分化诱导剂的培养基中进行。

配置工序中的细胞集合体的配置是将上述第1及第2细胞集合体配置在能保持细胞的接触状态的支持载体的内部。此时，各细胞集合体不会彼此混合。由于如上所述不混合各细胞集合体地进行配置，所以在细胞集合体间形成边界线。在本说明书中，将该配置形态适当表达为“间隔化”。

作为此处所用的支持载体，只要是能在内部培养细胞的支持载体即可，优选为与上述培养基的混合物。作为上述支持载体，可以举出胶原、琼脂糖凝胶、羧甲基纤维素、明胶、琼脂、水凝胶、Cellmatrix(商品名)、メビォ一ルゲル(商品名)、Matrigel(商品名)、弹力蛋白、纤维蛋白、层粘蛋白、细胞外基质混合物、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)等。上述支持载体具有将细胞配置在内部时能基本维持配置位置的硬度即可，可以举出凝胶状、纤维状、固体状的支持载体。其中，从细胞外基质混合物等凝胶容易提供适当的硬度和保持力的观点考虑，较优选胶原、琼脂糖凝胶、羧甲基纤维素、明胶、琼脂、水凝胶、Cellmatrix、メビォ一ルゲル、Matrigel、细胞外基质混合物、弹力蛋白、纤维蛋白、层粘蛋白。此处，所谓能维持细胞位置的硬度，通常为用作三维培养的硬度、即在保持细胞配置的同时不阻碍由增殖导致肥大化的硬度即可，可以容易地确定。

需要说明的是，此处，支持载体具有第1及第2细胞集合体可以在载体内部生长的程度的厚度即可，可以根据目标组织的大小等适当设定。

另外，支持载体具备使细胞不分散、能保持细胞的接触状态的保持力即可。此处所说的“接触状态”，优选在各细胞集合体中、或细胞集合体间，确实地使细胞相互作用的紧密(高密度)的状态，上述高密度的状态是指在细胞凝集体的情况下，例如，可以用能维持比简单彼此接触更强的密接状态的保持力来培养细胞。例如，在胶原的情况下，提供最终浓度为2～3mg/ml的浓度，即基于JIS-K6503-1996的方法(作为用直径为12.7mm的冲头挤压4mm所需的负荷进行测定)达到凝胶强度为120g～250g的浓度下适合使用的硬度。另外，该凝胶强度没有限定，对于其他种类的支持载体只要根据同样的评价方法可测得同样的强度，就可以优选用作本发明的支持载体。另外，通过混合1种或多种支持载体，可以得到相当于目标凝胶强度的硬度的支持载体。

所谓高密度的状态，是指与构成组织时的密度同等程度的状态，例如，为细胞集合体的情况下，在细胞配置时为5×10⁷～1×10⁹个/ml，为了在无损细胞活性的情况下确实地使细胞相互作用，优选为1×10⁸～1×10⁹个/ml，最优选为2×10⁸～8×10⁸个/ml的密度。以上述细胞密度调制细胞集合体时，通过离心使细胞凝集并沉淀化，可以在无损细胞存活的情况下简便地高密度化，所以优选。上述离心可以在无损细胞存活的相当于300～1200×g、优选为500～1000×g的离心力的旋转数下进行3～10分钟。在低于300×9进行离心时，细胞沉淀不充分，有时细胞密度降低，另一方面，在高于1200×g下离心时，有时细胞受到损伤，所以均不优选。

通过离心分离来调制高密度的细胞时，通常在用于离心分离细胞的管等容器中调制单一细胞的混悬液后进行离心分离，将沉淀物即细胞残留，尽可能除去上清液即可。从完全除去上清液的观点来看，此时所用的管等容器优选为进行过硅涂布的容器。

使用离心分离得到沉淀物时，可以将沉淀物直接配置到支持载体的内部。此时，优选目标细胞以外的成分(例如，培养液、缓冲液、支持载体等)的量在与细胞容量相等的量以下，最优选不含有目标细胞以外的成分。上述高密度的细胞集合体中，细胞紧密接触，有效地发挥细胞间相互作用。特别是将目标细胞以外的成分极少的细胞集合体配置在支持载体的内部时，通过支持载体的固化等进一步凝集，成为更紧密的状态。

以组织的状态使用时，优选进行酶处理等以除去对象细胞以外的结合组织等。目标细胞以外的成分较多时，例如，它们的量在与细胞容量相等的量以上时，不能充分发挥细胞间相互作用，所以不优选。

另外，第1细胞集合体与第2细胞集合体的接触优选第1细胞集合体与第2细胞集合体的接触为密接，特别优选将第2细胞集合体挤压于第1细胞集合体来进行配置。另外，用培养液、不阻碍氧透过的固态物包裹第1细胞集合体与第2细胞集合体的周围对于使细胞集合体之间的接触密接是有效的。在粘度不同的溶液中加入高密度的细胞混悬液进行配置，直接将溶液固化的方式也可达成容易地保持细胞的接触，故而优选。此时，以第1细胞集合体为牙胚间充质细胞的单一细胞集合物、以第2细胞集合体为牙胚上皮组织时，优选以牙胚上皮组织的釉质结节与第1细胞集合体接触的方式进行配置，但并不限定于此。

支持载体为凝胶状或溶液状等时，可以在配置工序后设置固化支持载体的固化工序。通过固化工序，配置在支持载体内部的细胞被固定在支持载体内部。支持载体的固化中可以直接应用通常使用的支持载体的固化条件。例如，在支持载体中使用胶原等能固化的化合物时，在通常使用的条件下，例如，在培养温度下使其静置数分钟～数十分钟，由此可以固化。由此，可以使支持载体内部的细胞间的结合固化，同时可以使该结合牢固。

本发明的制造方法的培养工序中，在支持载体内部培养第1细胞集合体及第2细胞集合体。该培养工序中，通过彼此紧密接触的第1细胞集合体及第2细胞集合体，可有效地进行细胞间相互作用，从而可再构成组织，即牙。

可以通过支持载体维持第1细胞集合体与第2细胞集合体的接触状态进行培养工序，该培养工序可以是用具有第1及第2细胞集合体的支持载体单独进行的培养，也可以是在其他动物细胞的存在下的培养。

作为培养期间，因配置在支持载体内部的细胞数与细胞集合体的状态、以及培养工序的实施条件而不同，但通常为1～300天，为了形成外侧具有牙釉质、内侧具有象牙质的牙，优选为1～120天，从能迅速提供的观点考虑，可以优选为1～60天。进而为了制成具备牙周组织的牙，通常为1～300天，可以优选为1～60天。

仅用支持载体进行培养时，可以采用在用于培养动物细胞的通常条件下的培养。此处的培养通常可以直接采用在动物细胞下的培养条件，也可以直接采用上述条件。另外，培养中可以添加来自哺乳动物的血清，还可以添加对于上述细胞增殖或分化有效的已知的各种细胞因子。作为上述细胞因子，可以举出FGF、BMP等。

另外，从组织或细胞集合体的换气或供给营养的观点考虑，优选使用器官培养。器官培养中，通常在适合动物细胞增殖的培养基上平铺多孔性膜，在该膜上放置被支持载体包埋的细胞集合体，由此进行培养。此处所用的多孔性膜中，优选为具有大量0.3～5μm左右的孔的膜，具体而言，可以举出Cell Culture Insert(商品名)、ァィソボァフィルタ一(商品名)。

在其他动物细胞的存在下进行培养时，由于受到来自动物细胞的各种细胞因子等的作用，可以尽快形成具有特定细胞配置的牙，所以优选。上述其他动物细胞的存在下的培养可以使用分离细胞或培养细胞而通过生物体外的培养来进行。

另外，可以将具有第1与第2细胞集合体的支持载体移植到生物体中，在生物体内进行培养。上述在生物体内的培养由于可以尽快形成牙、以及牙周组织，所以特别优选。此时，将第1和第2细胞集合体与支持载体一起移植到生物体内。

能用于该用途的动物可以优选举出哺乳动物，例如人、猪、小鼠等，更优选来自与牙胚组织相同种类的动物。移植人牙胚组织时，优选使用人、或变成免疫功能不全的人以外的其他哺乳动物。为了尽可能地正常产生动物细胞的器官或组织，作为适合上述生物体内生长的生物体部位，优选肾脏皮膜下、肠间膜、皮下移植、口腔内等。

作为移植的生长期间，根据移植时的大小与产生的牙的大小而不同，通常可以为3～400天。例如，移植到肾脏皮膜下的移植期间也根据移植的培养物的大小与再生牙的大小而不同，但从牙的再生与在移植部位产生的牙大小的观点考虑，优选为7～60天。

向生物体内移植前，可以在生物体外进行培养(前培养)。通过该前培养，使细胞间的结合和第1与第2细胞集合体之间的结合牢固，从而可以使细胞间相互作用更牢固，所以优选。结果可以缩短总体生长期。

前培养的期间可以为短期，也可以为长期。在长期例如3天以上、优选为7天以上的情况下，可以由牙胚产生牙芽，所以可以缩短移植后形成牙的时间，所以优选。作为前培养期，例如，作为在肾脏皮膜下进行移植时的器官培养，由于1～7天能有效再生牙，所以优选。

由本发明的制造方法制造的牙具有内侧为象牙质、外侧为牙釉质的牙所特有的细胞配置(结构)，并且优选还具备牙的前端(牙冠)与牙根的方向性。通过至少除上述特有的细胞配置、优选细胞配置之外，还具有方向性，也可以发挥作为牙的机能。因此，能广泛用作牙的代替物。特别是，使用来自本身的牙胚的间充质细胞与上皮系细胞时，可以在避免排斥反应导致的问题的情况下进行使用。另外，使用来自通常适合移植抗原的他人的牙胚的细胞时，也能避免因排斥反应导致的问题。

另外，通过本发明的制造方法制造的牙可以为具有牙特有的细胞配置的牙的集合体。

由于上述牙的集合体由具有牙特有的细胞配置的多颗牙构成，所以可以从聚合体中分离各个牙，按照以下所述的方式用作一个牙的移植片。结果，可以有效制作作为移植片的牙。

为了得到由多颗牙构成的牙的集合体，并为了容易再诱导用于产生多颗牙的牙胚，优选第1与第2细胞集合体均由单一细胞构成。

需要说明的是，与上述相同，培养工序可以为器官培养，也可以为在肾脏皮膜下的培养，但将所得的牙用作移植片时，优选为不与其他动物细胞接触、并且全部过程在体外调制的器官培养。

进而，本发明的制造方法中，可以将培养期间继续到形成牙周组织为止。由此，除牙本身之外，将牙支持在颚骨上，也可以形成固定化的牙槽骨和牙根膜等牙周组织。结果可提供一种移植后能实用的牙。

需要说明的是，为了制造牙周组织，可以在上述培养工序后设置分离由上述培养得到的牙周组织的工序，仅得到牙周组织。分离牙周组织只要可以分离在培养工序的过程中所形成的牙周组织与牙即可，可以用任意的方法进行，可以举出用镊子等进行分离或用酶进行部分消化等。

根据本发明得到的牙与牙周组织除可以用作移植片之外，还可以优选用于研究阐明牙的发生过程，也可以用作今后的对于产生与牙相关的组织有效的研究工具。

需要说明的是，将所得的牙或牙周组织用作移植片时，优选制造方法的培养工序为不与其他动物细胞接触并且全部过程可以在体外调制的器官培养。

另外，本发明包括牙的移植方法。该移植方法中，包括得到上述牙的集合体的工序；由牙的复合体分离各个牙的工序；调整分离的牙进行移植，使其具有与在移植部位的其他牙相同的方向性。

由此，可以同时得到具备特有的细胞配置与方向性的多颗牙，有效实施牙的移植。

本发明的牙可以适用于治疗或处置伴有牙欠缺与损伤的各种症状、例如龋齿、边缘性牙周炎(牙槽脓肿)、牙周病导致的牙欠缺、事故等导致的折损或脱落等。

即，本发明的治疗方法包括将由本发明的制造方法得到的牙及/或牙周组织移植到欠缺及/或损伤部位的步骤。由此，可以治疗及/或缓和欠缺及/或损伤部位的上述症状。

本发明的其他治疗方法包括在欠缺及/或损伤部位仅实施本发明的培养工序或配置工序与培养工序。此时，作为支持载体，除上述载体之外，还可以将欠缺及/或损伤部位的周围组织本身作为支持载体。由此，利用来自生物体内的周边组织的细胞因子等，可以更迅速地治疗欠缺及/或损伤部位等。

实施例

以下，说明本发明的实施例，但并不限定于此。另外，只要没有特别说明，实施例中的％均为重量(质量)基准。

[实施例1]

1.EC细胞的培养方法

EC细胞使用AT805细胞(作为129系EC细胞的OTT6050的派生克隆，由理化学研究所生物资源中心细胞材料开发室得到)。AT805细胞的培养使用添加了10容量％牛胎血清(FCS：JRH或JBS、Hyclone公司制)以及55μM 2-巯基乙醇(GIBCO公司制)的Dulbcco’s Modifed EagleMedium(DMEM：SIGMA公司或Kohjin-Bio公司制)来进行。通常以每100mm皿为5～8×10⁵个浓度来接种EC细胞，隔一天交换全部量的培养基进行反复继代培养。继代培养中，将细胞用HCMF缓冲液(pH7.4、10mMHepes、136.9mM NaCl、0.34mM Na₂HPO₃、13.9mM葡萄糖、5.37mM 23KCl)洗涤1次后，添加5ml最终浓度为0.025％的溶解有胰蛋白酶-EDTA·2Na(GIBCO公司制)的酶溶液，在37℃下进行1分钟酶处理。然后，加入等量的添加有10％FCS的DMEM，使细胞分散后，通过离心分离，回收沉淀，将沉淀回收得到的细胞再次混悬，接种在新的培养皿中，进行继代培养。

2.EC细胞的分化诱导与细胞的回收

将用胰蛋白酶处理回收后的EC细胞用最终浓度为0.5～5容量％的添加有二甲基亚砜(DMSO：SIGMA公司制)的添加10容量％FCS的DMEM混悬，以1.0×10⁶个/100mm皿的浓度进行接种。在CO₂浓度为5％的条件下，于37℃下培养，14小时后，用HCMF缓冲液将细胞洗涤1次，将培养液换成添加有10容量％FCS的DMEM。

对于用DMSO处理后的EC细胞，每3天将培养液的一半量换成添加10容量％FCS的DMEM，继续培养6天(仅5容量％DMSO，为19天)，进行适当观察。在含有未分化细胞的细胞集团增殖的时刻，用HCMF缓冲液洗涤1次后，添加3mM EDTA以及含有0.5％BSA且不含Ca²⁺、Mg²⁺的PBS(-)(EDTA/BSA-PBS)，将细胞分散，通过离心操作以沉淀的形式回收细胞。将细胞再次混悬在EDTA/BSA-PBS中，通过FITC标记的抗CD44抗体(CD44-FITC：BD Pharmingen公司制)与PE标记的抗CD29抗体(CD29-PE：BD Pharmingen公司制)进行双重染色，使用细胞分选仪、EpicsALTRA(Beckman Coulter公司制)分离获得CD44阳性且CD29阳性的细胞成分，由此得到除去了未分化EC细胞的用DMSO处理进行了分化诱导的EC细胞成分(参见图2)。将该细胞命名为DMSO-EC细胞。

另外，关于以各DMSO浓度处理时的DMSO-EC细胞的比例，示于表1。如表1所示，明确了CD44阳性且CD29阳性的细胞依赖于DMSO处理浓度而增加。需要说明的是，用5容量％DMSO处理得到的EC细胞由于大部分细胞在刚处理后就死亡，所以处理后的培养天数必须比其他处理浓度长，另一方面，培养后所得的CD44阳性且CD29阳性的细胞比例较高。

在以下的实验中，使用由使用5容量％的DMSO而得到的细胞。

[表1]

  DMSO浓度  (v/v％)  培养天数  (天)  细胞数  (×10⁷个)  CD44阳性且CD29阳  性细胞(％)  0  0.5  6  1.15  0.3  1.0  6  1.19  0.5  2.5  6  1.64  13.7  5.0  19  2.83  93.0

DMSO-EC细胞的克隆化

DMSO-EC细胞的克隆化通过利用克隆环的菌落的分离、或者极限稀释法来进行。

利用克隆环获得细胞时，以低浓度(约100个)在培养皿中接种DMSO-EC细胞并通过增殖而能够得到的菌落的细胞数为10个以上，此时将灭菌后的硅脂涂布在克隆环的一端，以包围细胞的菌落的方式粘附在除去培养基的皿底面。然后，在克隆环内进行胰蛋白酶处理，回收细胞，由增殖的细胞依次进行放大培养，获得克隆。

用极限稀释法得到克隆如下进行：将通过上述方法得到的DMSO-EC细胞用HCMF缓冲液洗涤1次后，通过胰蛋白酶处理回收细胞。计测回收得到的细胞数，接种在96孔培养板中，使其达到1细胞/200μl/孔(说明)。3～5天后确认单一菌落。然后，每5天，边交换一半量的培养基边继续培养，从增殖的细胞依次进行放大培养，获得克隆。

由此，得到来自DMSO-EC细胞的克隆1(DMSO-EC克隆1：Clone#1)与克隆2(DMSO-EC克隆2：Clone#2)。

[实施例2]

DMSO-EC细胞的性状

(1)相位差显微镜像

用相位差显微镜分别观察上述得到的克隆1与2的形态与EC细胞、DMSO-EC细胞、以及作为来自EC细胞的软骨系前体细胞的ATDC5细胞(从理化学研究所生物资源中心细胞材料开发室得到)的形态。

结果，观察到EC细胞中，菌落内的细胞小，以高密度增殖，此外，菌落周边突起，是典型的全能性干细胞样的形态。与此相对，DMSO-EC或DMSO-EC克隆1与2、ATDC5细胞中，构成菌落的每个细胞面积较大，形成作为粘附性细胞的特征即单一层，显示与特征EC细胞的形态明显不同的形态。相较于EC细胞，上述粘附性的细胞形态类似于间充质细胞。

(2)各种基因表达

通过实时(Real time)PCR(RT-PCR)解析EC细胞、DMSO-EC、DMSO-EC克隆1与2、ATDC5细胞中的各种基因表达，研究各种标识基因的表达。

使用TRIzol Reagent(Invitrogen公司制)从EC细胞以及DMSO-EC、DMSO-EC克隆1与2、ATDC5细胞中提取全RNA。除去解析的细胞培养液，在100mm培养皿中直接滴入2ml TRIzol Reagent，用Cell Scraper(Falcon公司制)充分混合后，回收到离心管中，用Polytron Homogenizer(Polytron公司制)进行匀浆。然后至提取RNA为止的操作根据后附的使用说明书来进行。将从细胞·组织中提取的全RNA溶解于DEPC处理水中，用分光光度计进行浓度计算后，保存在-30℃。

为了进行实时PCR(RT-PCR)解析，以从细胞提取的全RNA为模板，合成形成模板的cDNA。cDNA合成使用ReverTra Ace(TOYOBO)来进行，根据后附的使用说明书进行操作。

PCR与解析使用ABI PRISM 7000(Applied Biosystems公司制)来进行。聚合酶使用SYBR Premix Ex Taq(TAKARA公司制)，内部对照使用β-肌动蛋白。在RT-PCR专用96孔板中以每个试样分别添加13μl SYBR Premix ExTaq(TAKARA公司制)、2μl稀释20倍得到的cDNA反应溶液、5μl浓度为1μM的引物，添加5μl灭菌水，调制最终容量为25μl的反应体系，根据常规方法进行PCR反应。另外，对各个基因进行对照反应，制作标准曲线，分别进行定量化。将用于解析的引物序列示于表2与表3。

基因表达通过各个细胞中的β-肌动蛋白的表达量进行标准化，与β-肌动蛋白表达量为一定时的相对表达量进行比较。结果示于表4。

[表2]

  Oct3/4-F  Oct3/4-R  nanog-F  nanog-R  Slug-F  Slug-R  Pax3-F  Pax3-R  Wnt1-F  Wnt1-R  Sox9-F  Sox9-R  Sox5-F  Sox5-R  Msx1-F  Msx1-R  Pax9-F  Pax9-R  ATTGAGAACCGTGTGAGGTGGA  GCGCCGGTTACAGAACCATAC  CAAGGGTCTGCTACTGAGATGCT  ATCAGGGCTGCCTTGAAGAG  GACCCTGGCTGCTTCAAGGA  TATTGCAGTGAGGGCAAGAG  CAAGCTGGAGCCAATCAACTG  GCGGTGGGAGGGAATCC  CCTACGCTTCCTCATGAACCTT  TGGCGCATCTCAGAGAACAC  GAGGCCACGGAACAGACTC  CAGCGCCTTGAAGATAGCATT  GCGTTGGACGGGAAGGT  TCCTTTTCTGTCCGGCAGTT  CAGCCCTATAGAAAGCAAGGA  CCCCTCAGAGCAATGCTTTG  GGCCAGGCACCGAATG  GCCATGCTGGATGCTGAGA  (序列号：1)  (序列号：2)  (序列号：3)  (序列号：4)  (序列号：5)  (序列号：6)  (序列号：7)  (序列号：8)  (序列号：9)  (序列号：10)  (序列号：11)  (序列号：12)  (序列号：13)  (序列号：14)  (序列号：15)  (序列号：16)  (序列号：17)  (序列号：18)

[表3]

  Wnt5a-F  Wnt5a-R  Lhx8-F  Lhx8-R  BMP4-F  BMP4-R  Runx2-F  Runx2-R  Dlx1-F  Dlx1-R  FGF10-F  FGF10-R  BMP7-F  BMP7-R  βActin-F  βActin-R  CGCCATGAAGAAGCCCATT  TCCAGCGGTCCCCAAAG  AAGTGGAGAACGGTAATGGGATTAG  GCTTTGGATGATTGACGTCTTG  TCAAGACACCATGATTCCTGGTAA  GCTCGCGCCTCCTAGCA  ACGGCCCTCCCTGAACTC  GGGATCTGTAATCTGACTCTGTCCTT  AGCCGAGCCCGAGCTT  CAGCCGGTCCTTCCTAGAAGTT  TCCCTCTGGGTACGGATCTG  TGGTCGGCTCTCTTGCATAA  CGCTCCAAGACGCCAAAG  GCTGCTGTTTTCTGCCACACT  TGACAGGATGCAGAAGGAGA  GCTGGAAGGTGGACAGTGAG  (序列号：19)  (序列号：20)  (序列号：21)  (序列号：22)  (序列号：23)  (序列号：24)  (序列号：25)  (序列号：26)  (序列号：27)  (序列号：28)  (序列号：29)  (序列号：30)  (序列号：31)  (序列号：32)  (序列号：33)  (序列号：34)

[表4]

如表4所示，仅在EC细胞中检测出作为未分化干细胞标识基因的Oct3/4与Nanog的表达，在用DMSO处理而得到的EC细胞或其克隆细胞、ATDC5细胞中未确认到。在EC细胞中未确认作为神经嵴细胞标识基因的Slug、Pax3、Wnt1的表达，而在EC细胞以外的所有细胞组中确认到Slug，虽然有表达量的差异，但在EC细胞与ATDC5细胞以外的DMSO-EC细胞组中确认到Pax3与Wnt1。

由此提示了DMSO-EC细胞与其克隆化细胞是因为添加了DMSO而由未分化干细胞分化诱导为神经嵴细胞的细胞，由基因表达的特性可知，是Oct3/4阴性、Nanog阴性、Slug阳性、Pax3阳性、Wnt1阳性的细胞。

另一方面，在牙间叶细胞的标识组中，除在EC细胞中表达Msx1与BMP-7之外，其他任意基因均未表达，而在DMSO-EC细胞、以及其克隆化细胞中，特异性地高度表达了Msx1、Pax9、Wnt5a、Lhx8。虽然表达量有少许差异，但在DMSO-EC细胞以及其克隆化细胞和ATDC5细胞中确认到BMP4、Runx2、Dlx1的表达。

另外，判断如下：作为软骨细胞的特异性标识基因即Sox9、Sox5的表达仅在ATDC5细胞中高度表达，DMSO-EC细胞和其克隆化细胞为不分化为软骨系的细胞。

因此，明确了通过DMSO，EC细胞向神经嵴细胞样或间充质细胞样的细胞分化诱导。

[实施例3]

评价由EC细胞分化诱导的细胞的牙形成性能

然后，按照以下所述的方式，确认由本发明得到的DMSO-EC细胞、其克隆化细胞具有向牙本质细胞分化的性能、以及牙的象牙质形成性能。

(1)牙胚上皮组织的调制

在显微镜下通过常规方法从C57BL/6小鼠(由SLC购得)的胎龄14.5天的胚仔中摘出下颚切牙牙胚组织。用PBS(-)洗涤摘出的下颚切牙牙胚组织，在室温下用在PBS(-)中添加最终浓度为1.2U/ml的分散酶II(Roche，Mannheim，Germany)而得到的酶液，处理12.5分钟后，用添加有10％FCS(JRH Biosciences，Lenexa，KS)的DMEM(Sigma，St.Louis，MO)洗涤3次。进而，添加DNaseI溶液(Takara，Siga，Japan)使其达到最终浓度为70U/ml，使牙胚组织分散，使用25G注射针(Terumo，Tokyo，Japan)，外科上分离牙胚上皮组织。

(2)再构成牙胚的制作

再构成牙胚的制作中使用上述调制得到的牙胚上皮组织，以及作为间充质细胞的EC细胞、DMSO-EC细胞、DMSO-EC克隆1和2中的任一个评价对象细胞。

分别通过胰蛋白酶处理从皿中回收用于牙胚再构筑的评价对象细胞组。在涂布有硅脂的1.5ml微管(Eppendorf，Hamburg，Germany)中加入用添加有10％FcS(JRH)的DMEM(Sigma)混悬而得到的评价对象细胞，利用离心分离(580×g)将细胞以沉淀的形式回收。尽可能除去离心后的培养液的上清液，再次进行离心操作，边用实体显微镜观察边使用GELoaderTip0.5-20μL(Eppendorf公司制)完全除去残留在细胞沉淀周围的培养液，准备用于制作再构成牙胚的各个评价对象细胞。

在涂布有硅脂的皮氏培养皿中滴入30μl 2.4mg/ml的Cellmatrix typeI-A(新田明胶公司制)，制作胶原凝胶微滴。使用0.1-10μl的吸头(Eppendorf公司制)，向该溶液中供给0.2μl～10.3μl上述评价对象细胞，制成细胞凝集体作为高密度的细胞集合体(细胞密度：2×10⁸个/ml)。然后，使用10μl吸头，将牙胚上皮组织或牙胚间叶组织供给到相同的凝胶液滴内，使用钨针，使来自分离到的牙胚的上皮组织原本与间叶组织接触的面密接于评价对象细胞的细胞凝集体。然后，通过使凝胶液滴固化，使牙胚组织与评价对象细胞间的结合更牢固，从而制作高密度的再构成牙胚。

参见图3说明这点。

利用吸头16预先配置于凝胶液滴10(参见图3A)内的细胞凝集体12在凝胶液滴10内构成球体(参见图3B)。然后通过挤入另一种细胞凝集体14，从而球体的细胞凝集体12被破坏，包裹另一种细胞凝集体14的情况较多(参见图3C)。然后，将凝胶液滴10固化，由此细胞间的结合变牢固(参见图3D)。

(3)再构成的牙胚的器官培养

将在凝胶中制作的高密度再构成牙胚在CO₂培养箱中静置10分钟，将Cellmatrix type I-A(Nitta Gelatin)固化。准备培养容器，使Cell CultureInsert(孔径尺寸为0.4微米的PET膜；BD公司制)接触添加有10容量％FCS(JRH公司制)、0.1mg/ml的L-抗坏血酸(Sigma公司制)、2mM的L-谷氨酰胺(GIBCO公司制)的DMEM(Sigma公司制)。将再构成牙胚与作为支持载体的周围凝胶一起转移到培养容器的Cell Culture Insert的膜上，进行器官培养。

对利用器官培养而产生牙的现象进行解析时，通常进行14天间的培养。器官培养时，在移植后第10～30天摘出再构成牙胚，用4％仲甲醛-磷酸缓冲液固定6小时后，使用4.5％EDTA溶液(pH7.4)进行24小时的中性脱灰。然后，通过常规方法进行石蜡包埋，制作10μm的切片。为了进行组织学解析，根据常规方法进行苏木素-伊红染色染色(HE染色)。

用器官培养进行评价

在14.5日龄、下颚切牙牙胚上皮组织与EC细胞的高密度再构成牙胚中，因EC细胞的异常增殖而再构成牙胚肥大化，在HE染色中也未观察到来自牙间叶细胞的牙本质细胞和象牙质。

与此相对，在DMSO-EC细胞、DMSO-EC克隆1与2中，与上皮组织的相互作用被诱导，并且在相位差显微镜像中也观察到与牙胚的器官培养同样地组织诱导。进而，DMSO-EC细胞、DMSO-EC克隆1与2均可以由HE染色像确认可以形成外侧具有牙釉质、内侧具有象牙质的再构成牙胚的HE染色像，能形成牙特有的组织结构。

由上述内容可知，DMSO-EC细胞、DMSO-EC克隆1与2通过与牙胚上皮细胞的相互作用，分化为作为牙的间叶组织的牙本质细胞，可以产生牙特有的象牙质。另外，通过高密度再构成牙胚法，在器官培养中，也可以形成外侧为牙釉质、内侧为象牙质、内部为牙髓细胞、具有牙前端与牙根的牙所特有的组织结构的牙。

[实施例4]

肾皮膜下移植方法

下面，由DMSO-EC细胞、DMSO-EC克隆1和2的细胞与14.5日龄胎儿下颚切牙牙胚上皮细胞制作高密度再构成牙胚，将所得的再构成牙胚移植到C57BL6小鼠(从日本Clea公司购得)肾皮膜下，评价牙形成性能。

将与实施例3相同地制作的再构成牙胚进行器官培养48小时至96小时后，将周围的每份凝胶移植到8周龄NOD-SCID小鼠(从Charles River公司购得)的肾皮膜下，使其进行不同场所的牙的产生，并进行解析。

移植到肾皮膜下时，在移植后第10～30天，对于周围的每个肾组织，摘出再构成牙胚。将摘出组织在4％仲甲醛-磷酸缓冲液中固定6小时后，使用4.5％EDTA溶液(pH7.4)，进行24小时的中性脱灰。然后，根据常规方法进行石蜡包埋，制作10μm的切片。为了进行组织学解析，根据常规方法进行HE染色。

(1)用肾皮膜下移植的评价

在肾皮膜下移植中，移植14.5日龄胎儿切牙牙胚时，在16天的期间内因肾皮膜下移植而产生具有内侧为象牙质与外侧和牙釉质的特征结构的牙(参见图4)。用来自14.5日龄胎儿切牙牙胚的牙胚上皮组织和牙胚间叶细胞(参见图4A)、牙胚上皮组织和DMSO-EC细胞(参见图4B)、牙胚上皮组织和DMSO-EC克隆(克隆#1、参见图4C)的再构成牙胚中，通过肾皮膜下移植进行移植后第14天，与直接将正常牙胚移植到肾皮膜的情况相同，容易确认外侧为釉质芽细胞、牙釉质，其内侧为象牙质、牙本质细胞。所形成的牙具有前端与牙根，具有与正常产生的牙相同的结构。

关于形成牙的频率，在EC细胞与ATDC细胞中为0％，而在DMSO-EC细胞中为51.3±8.8％，在DMSO-EC克隆1中为23.3％±16.7％，在克隆2中为33.3％±47.1％。

由上述内容可知，DMSO-EC细胞、DMSO-EC克隆1与2中，能分化为作为来自牙间叶的组织的牙本质细胞，并能产生作为牙的硬组织的象牙质。进而可知，通过高密度再构成牙胚法，即使在肾皮膜下移植中，也可以通过DMSO-EC细胞、DMSO-EC克隆1与2形成具有特有的组织结构的牙。

(2)原位杂交

将来自14.5日龄胎儿切牙牙胚的牙胚上皮组织与DMSO-EC细胞移植到皮膜下，对14天后摘出的组织，通过原位杂交解析作为牙釉质的构成分子的牙釉质蛋白、作为象牙质的构成要素的牙本质涎磷蛋白(DSPP)的mRNA表达、以及作为牙根膜特异性基因的Periostin mRNA表达。

摘出肾皮膜下移植后第14天的再构成牙胚，用4％仲甲醛-磷酸缓冲液固定6小时后，使用4.5％EDTA溶液(pH7.4)，进行24小时的中性脱灰。然后，依次浸渍12.5％蔗糖溶液、25％蔗糖溶液后，包埋在OCT compound(SAKURA Finetechnica公司制)中。包埋后在低温恒温器(Leica公司制)中制作10μm的切片。

将上述切片用含有最终浓度为2μg/ml的蛋白酶K(Nacalaitesque，kyoto，Japan)的PBS(-)处理10分钟，用含有最终浓度为4％的仲甲醛(Nacalai tesque)的PBS(-)固定10分钟。分别用含有最终浓度为1.325％三乙醇胺、0.0175N的HCl(Wako)、0.25％乙酸酐的丙酸二乙酯处理(DEPC)水处理10分钟后，用PBS(-)在5分钟内洗涤3次。用含有1.5％(v/v)三乙醇胺(Nacalai tesque)、0.33N的HCl(Wako)、0.25％(v/v)的乙酸酐(Nacalai tesque)的DEPC水溶液处理10分钟后，用2×SSC在10分钟内洗涤2次。作为牙根膜特异性基因的Periostin(Genbank accession no.NM_015784)探针，将使用正义引物(-7；ggctgaagatggttcctctc：序列号35)与反义引物(573；gtacattgaaggaataacca：序列号36)并通过PCR而获得的cDNA片段作为DIG标识。

根据常规方法进行原位杂交，用抗DIG-碱性磷酸酯酶(AP)Fab片段(Roche)和NBT/BCIPStock Solution(Roche)使其显色，用Axio ImagerA.1(Zeiss)与AxioCam MRc5(Zeiss)进行解析。

由该结果可知，在HE染色像的釉质芽细胞中，确认到牙釉质蛋白mRNA的表达，在牙本质细胞中确认到DSPPmRNA的表达。另外，确认到Periostin mRNA的表达。由此可知，与形成硬组织相关的分子的mRNA分别适当地在其产生细胞中明显表达。另外，由于检测到在牙根膜中表达的Periostin，提示形成有牙周组织。

[实施例5]

用视黄酸进行诱导

(1)用于获得CD44阳性且CD29阳性细胞的EC细胞分化诱导方法

与实施例1相同地操作，以1.0×10⁶个/100mm皿的浓度接种用胰蛋白酶处理回收得到的AT805细胞，第二天，置换成添加有终浓度为0～10.0μM的视黄酸(RA)(SIGMA公司制)的10容量％FCS DMEM，施加刺激。培养72小时后，用HCMF缓冲液洗涤2次，用全部量的10容量％FCS DMEM进行培养基交换。

(2)获得RA处理后的CD44阳性且CD29阳性细胞

每3天使用10容量％FCSD MEM进行一半量的培养基交换，同时继续培养7天，进行适当观察。将RA处理后增殖的含有未分化细胞的细胞集团用HCMF洗涤1次后，添加3mM的EDTA-0.5％BSA-PBS(-)，在37℃下进行培育，回收。回收后的细胞通过CD44 FITC(BD Pharmingen)与CD29(BDPharmingen)PE进行双重染色，使用Epics ALTRA(Beckman Coulter)分离获得CD44阳性且CD29阳性的细胞，由此仅得到除去了未分化细胞的细胞集团。将该细胞命名为RA-EC细胞。结果示于图5。

另外，用各RA浓度处理时的RA-EC细胞的比例示于表5。由表5明确，CD44阳性且CD29阳性细胞依赖于RA浓度而发生变化。

另外，对于RA处理后的CD44阳性且CD29阳性细胞，与实施例2(2)相同地确认基因表达时，判定与DMSO-EC细胞相同，为Oct3/4阴性、Nanog阴性、Slug阳性、Pax3阳性、Wnt1阳性的细胞。

[表5]

  RA浓度  (μM)  培养天数  (天) 细胞数(×10⁶个)  CD44阳性且CD29阳性细胞  (％)  0  0.5  7  1.5  10.8  1.0  7  1.1  10.0  2.0  7  1.3  11.3  5.0  7  0.5  11.5  10.0  7  0.7  10.4

(3)RA处理后的CD44阳性且CD29阳性细胞的牙形成性能评价

使用如上所述得到的CD44阳性且CD29阳性细胞(RA浓度2μM)，与实施例3相同地操作，进行牙胚再构筑及器官培养，并进行评价。在器官培养14天后，通过与牙胚上皮细胞的相互作用，分化为作为牙间叶组织的牙本质细胞。另外，通过高密度再构成牙胚法，形成具有外侧为牙釉质、内侧为象牙质、内部为牙髓细胞的牙所特有的组织结构的牙(参见图6)。

并且对RA处理后的CD44阳性且CD29阳性细胞，与实施例4(2)相同地操作，确认牙釉质蛋白与DSPP、Periostin表达时，确认与DMSO-EC相同地表达各mRNA。这提示了形成含有硬组织、牙根膜的牙周组织。

[实施例6]

(1)用于获得CD44阳性且CD106阳性细胞的EC细胞分化诱导方法

与实施例1相同地操作，以1.0×10⁶个/100mm皿的浓度接种通过胰蛋白酶处理回收得到的AT805细胞，第二天置换成终浓度为2μM的RA(SIGMA公司制)的10容量％FCS DMEM，施加刺激。培养72小时后，用HCMF缓冲液洗涤2次，用全部量的10容量％FCS DMEM进行培养基交换。第二天，用HCMF缓冲液洗涤2次，除去死细胞后，进而用10容量％FCS DMEM继续培养。以后每隔1天进行培养基交换，培养7天。

(2)获得CD44阳性且CD106阳性的细胞

用HCMF将含有通过上述处理获得的未分化细胞的细胞集团洗涤1次后，添加3mM EDTA-0.5％BSA-PBS(-)，在37℃培育，回收。将回收后的细胞通过CD44 FITC(BD Pharmingen)与抗CD106抗体(CD106(BDPharmingen)PE)进行双重染色，使用Epics ALTRA(Beckman Coulter)分离获得CD44阳性且CD106阳性成分，由此仅得到除去了未分化细胞的细胞集团。结果示于图7。

(3)RA处理后的CD44阳性且CD106阳性细胞的牙形成性能评价

使用如上所述得到的CD44阳性且CD106阳性细胞，与实施例3相同地操作，进行牙胚再构筑与器官培养，并进行评价。器官培养14天后，通过与牙胚上皮细胞的相互作用，分化为作为牙的间叶组织的牙本质细胞。另外，通过高密度再构成牙胚法，形成具有外侧为牙釉质、内侧为象牙质、内部为牙髓细胞的牙特有的组织结构的牙。

另外，对于上述CD44阳性且CD106阳性的DMSO-EC细胞，与实施例2(2)相同地确认基因表达。结果，显示与CD44阳性且CD29阳性DMSO-EC细胞相同，为Oct3/4阴性、Nanog阴性、Slug阳性、Pax3阳性、Wnt1阳性的细胞。

进而，与实施例4(2)相同地操作，确认牙釉质蛋白与DSPP、Periostin表达时，确认与DMSO-EC相同地表达各mRNA。这提示了形成含有硬组织、牙根膜的牙周组织。

[实施例7]

与实施例6(2)和(3)相同地操作，使用CD44 FITC与CD106 PE对DMSO-EC细胞进行双重染色，显示存在CD44阳性且CD106阳性细胞。对于上述CD44阳性且CD106阳性的DMSO-EC细胞，与实施例2相同地确认基因表达时，判定与CD44阳性且CD29阳性DMSO-EC细胞相同，为Oct3/4阴性、Nanog阴性、Slug阳性、Pax3阳性、Wnt1阳性的细胞。

使用此处所得的CD44阳性且CD106阳性细胞的细胞集团，与实施例3和实施例4(2)相同地进行牙胚再构筑、器官培养与mRNA表达，并进行评价。结果通过与牙胚上皮细胞的相互作用形成具有特有的组织结构的牙。另外，与实施例4(2)相同地操作，确认牙釉质蛋白与DSPP、Periostin表达。这提示了能形成含有硬组织、牙根膜的牙周组织。

如上所述，可以由全能性干细胞分化诱导CD44阳性且CD29阳性细胞或CD44阳性且CD106阳性细胞，通过将上述细胞与上皮系细胞一起间隔化进行培养，由此再构成牙胚，从而可以提供具有牙釉质与象牙质的特有结构的牙。

因此，根据本发明，可以由全能性干细胞得到牙形成用间充质细胞，并可以有效大量地制作牙。

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