人乳铁蛋白（hLF）cDNA的克隆及生物信息学分析

摘要

本文为了研究不同个体或组织的hLF的碱基及氨基酸序列是否存在差异和进一步探讨该基因的异源表达特性，从正常人外周血液中分离中性粒白细胞(WBC)，提取总RNA；以Oligo(dT)为引物合成第1条cDNA链，将LF基因分成1.5和0.8kb 2个cDNA片段进行扩增，分别获得预期的cDNA片段，将其插入pMD18-T载体中，得到2种重组质粒，经鉴定后再将2个cDNA片段切下来，与巴氏毕赤酵母表达载体pPICZα-A相连，获得含有完整LF基因的重组表达质粒pPICZα-hLF。对所克隆到的hLF cDNA序列进行测定，结果表明，其cDNA全长为2，136bp，编码711个氨基酸残基。DNA序列与登录的来自人不同组织的hLF序列进行比对，结果表明，碱基同源性达99％，有21个碱基发生了变化，其中有7个碱基变异不导致氨基酸的改变；氨基酸同源性为96～97％。 利用Vector NTI、DNAMAN和DNA Tools等生物软件对hLF进行生物信息学分析。分析结果表明：(1)hLF的二级结构以α螺旋和β-折叠为主，二者沿蛋白质的氨基酸顺序交替排列，且α-螺旋大大多于β-折叠；(2)三级结构在二级结构的基础上折叠成2个基本相等的叶，每个叶进一步形成2个结构域和1条裂隙；(3)选择9个哺乳动物类不同物种的LF氨基酸序列进行同源性比对，分析表明，人与其他物种的同源性程度从高到低依次是家鼠、山羊、牛、猪、猩猩、美洲旱獭、兔、狗；(4)hLF分子量为78,414Da，等电点为8.05；(5)hLF的氨基酸组成中，中性疏水氨基酸使用频率为39.1％，中性亲水氨基酸频率为35.7％，带电碱性氨基酸频率为14.1％，带电酸性氨基酸频率为11.1％；(6)hLF肽链的疏水区预测是：hLF的N端和C端都具有很高的疏水性，疏水区位于分子的内部。

目录

论文说明：图表目录

1引言

2材料和方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3结果

3.1 hLF cDNA的扩增

3.2 hLF cDNA的克隆

3.3 hLF全长cDNA的连接及表达质粒的构建

3.4 hLF的cDNA序列分析

3.5 hLF二级结构的预测

3.6 hLF三级结构的预测

3.7 hLF蛋白的氨基酸序列的同源性比对

3.8 hLF的性质与结构预测

3.8.1蛋白质分子量及等电点

3.8.2蛋白质的氨基酸组成

3.8.3蛋白质的疏水区预测

4讨论

4.1 hLF碱基同源性

4.2 hLF二级结构的预测

4.3 hLF三级结构的预测

4.4 hLF氨基酸的同源性

4.5 hLF的氨基酸组成

4.6 hLF在毕赤酵母中的表达

小结

参考文献

文献综述：乳铁蛋白研究进展

摘要

前言

1 LF的来源

2 LF的分子结构及理化性质

2.1分子结构

2.2化性质

3 LF的生物学功能及作用机理

3.1结合功能

3.2促进铁吸收

3.3抑菌作用

3.4抗病毒作用

3.5调节免疫

3.6促进肠道及肠道内双歧杆菌生长

3.7抗氧化

3.8抗感染活性

3.9杀菌作用

3.10基因调节作用

3.11LF的其他功能

4 LF的测定方法

4.1酶联免疫吸附法(ELISA法)

4.2高效液相色谱法(HPLC)

4.3分光光度法

4.4放射免疫(RIA)扩散法

4.5铁蛋白免疫印迹法（Western-Bot）

4.6免疫组织化学染色法

5LF的分离与纯化

5.1吸附色谱法

5.2离子交换色谱法

5.3亲和色谱法

5.4固定化单克隆抗体法

5.5超滤法

5.6等电点沉淀和膜分离集成法

5.7膜分离和色谱组合法

5.8盐析和有机溶剂沉淀法

5.9金属螯合色谱法

6基于LF的功能性实验

6.1动物实验

6.2人体实验

6.3防治肝炎

7人LF基因研究进展

8LF的应用展望

8.1猪饲料工业

8.2牛饲料工业

8.3鱼类疾病防治

8.4乳品工业

8.5医学上

参考文献

致谢

在读期间发表及待发表的论文

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