TK基因突变试验——三种人类淋巴母细胞的比较及两类突变集落形成的机理研究

摘要

TK基因突变试验是七十年代发展起来的一种用于初筛致癌物和致突变物的方法。经过近三十年的发展，其检测机理已基本阐明，并已积累了大量的实验数据。与其它遗传毒性检测方法比较，TK基因突变试验具有快速、敏感等特点。而且，TK基因突变试验不仅可检出tk位点的突变，还可检出大的缺失、重组、染色体异倍性和其他较大范围的基因组改变等多种许多遗传学改变。目前，国外已将TK基因突变试验广泛使用于化学物致突变性评价以及致癌物和致畸物的初筛，近年来在我国也开展了该试验的推广工作，在我国卫生部2003年新版的《保健食品检验与评价技术规范》和国家标准《食品安全性毒理学评价程序和方法》(GB15193-2003)中，已将TK基因突变试验列为备选的遗传毒性试验方法之一。 TK基因突变试验采用的靶细胞系主要有小鼠淋巴瘤细胞L5178Y-3.7.2C以及人类淋巴母细胞TK6、WTK1和TK6-E6等。L5178Y细胞是TK基因突变试验的经典靶细胞，其试验方法已趋于完善。近年来，国内外学者对人类来源的TK6、WTK1等细胞在TK基因突变试验中的应用也做了一些工作，但资料还很有限。 在TK基因突变分析中可观察到两类明显不同的集落，即大、小集落(或正常生长与缓慢生长集落)。关于其发生机理，大多数学者认为大集落主要源于小的突变，如点突变，移码突变，而小集落主要由于大的片断丢失，影响到了一些与生长相关的基因。有学者提出可以根据小集落比例判断诱变物的类型，但是也有学者对此持反对意见，至今尚无定论。 本研究的目的是优选一种相对最佳的人类淋巴母细胞应用于TK基因突变试验系统，并从多个方面探讨正常生长和缓慢生长集落的形成机制，为TK基因突变试验的推广积累更多资料。 本课题分为以下三部分：第一部分：TK6-E6细胞在TK基因突变系统中的应用。目的是为了评价该细胞系应用于TK基因突变试验的优劣。结果显示，TK6-E6细胞在本实验室条件下测得的倍增时间为16.03±0.61h，自发突变频率为29.9±5.47×10-6，平板接种效率为63.8±4.6％，突变频率测定的平板的最适接种细胞量为10000/孔，阳性对照MMS的适宜浓度为1.25μg/ml。用TK6-E6细胞作为TK基因突变试验的靶细胞检测三种常规诱变剂(MMS、MMC、NaN3)和一种非诱变剂(KCl)，结果表明三种诱变剂均为明显阳性反应，而KCl为阴性结果。提示TK6-E6细胞作为TK基因突变试验的靶细胞有较好的应用前景。 第二部分：WTK1、TK6和TK6-E6三种人类淋巴母细胞在TK基因突变试验中的应用比较。目的是为了选择一种相对最优的人类淋巴母细胞，为将其推广应用于TK基因突变试验系统积累资料。方法是使用这三种细胞检测三种常规诱变剂(MMS、MMC、NaN3)和一种非诱变剂(KCI)。结果表明，三种细胞中以WTK1细胞的自发突变频率和诱发突变频率最高，TK6-E6细胞次之，TK6细胞最低；对受试物的细胞毒性耐受以WTK1细胞最强，TK6细胞次之，TK6-E6细胞最弱；平板接种效率以WTK1细胞最高，TK6细胞次之，TK6-E6细胞最低。结合三者的p53位点功能状态，建议重点推广WTK1细胞在TK基因突变分析中的应用。本研究还发现，不仅突变集落有正常生长和缓慢生长之分，接种的PE3平板集落也有增殖快慢的现象，即在第12天到第24天之间，PE3平板上还有一些集落长出，且在TK6细胞的试验结果中新增集落数与受试物的剂量呈正相关，故计算突变频率时宜以第24天计数的PE3为基准。 第三部分：正常生长(NC)和缓慢生长(SC)集落的比较。目的是为了探索两类集落的形成机理。采用核型分析和杂合性丢失、RT-PCR等方法对这两类集落的形成机制作了较全面的研究。结果显示，SC的增殖速度比正常细胞慢一倍左右；自发突变的SC集落比例以TK6-E6细胞最高，TK6细胞最低。MMC和MMS诱发的SC集落增加的比例在TK6细胞最为明显；断裂剂MMC和MMS诱导SC增加的比例显著高于点突变剂NaN3诱发SC增加的比例，但在TK6-E6和WTK1细胞中并未发现同样的现象。 对WTK1的60多个突变集落进行了核型分析，结果显示，突变集落出现17号染色体的多种异常，但17号染色体异常的频率与集落类型的关系不明显。本研究还发现诱发的突变集落17号染色体异常的频率显著高于自发突变集落。 对TK基因的外显子7进行杂合性丢失分析，同时扩增B-glboin做为参照，结果显示杂合性丢失的比例与集落类型无关，但诱发SC的杂合性丢失比例高于自发SC。 RT-PCR检测TK基因和两个生长相关基因(survivin基因和grb2基因)的改变，结果显示大部分突变集落丢失了tk片断，survivin基因和grb2基因也有不同程度的缺失，还发现grb2基因缺失的集落几乎都同时发生了survivin基因的缺失。统计结果显示survivin基因和grb2基因的缺失与集落类型无相关性，提示这两个基因可能不是影响NC和SC增殖速度的主要因素；研究还发现这两个基因丢失的比例在诱发突变集落高于自发突变集落，提示诱发突变的损伤范围和程度可能大于自发突变。综上，p53缺陷型的TK6-E6细胞在TK基因突变分析中有较高的平板接种效率、较高的自发和诱发突变频率，且能准确鉴定三种典型诱变剂和一种非诱变剂，有值得继续研究和推广应用的价值。 三种人类淋巴母细胞中，p53突变型的WTK1细胞具有自发和诱发突变频率最高，平板接种效率最高，对受试物耐受性最强等特点，故建议重点推广该细胞系在TK基因突变分析中的应用。 计数PE3平板时，宜在第12天和第24天各计数一次，并以第24天计数的PE3为基准计算突变频率。 正常和缓慢生长突变集落的17号染色体异常比例无显著差异。TK基因外显子7杂合性丢失，以及tk片断、survivin和grb2基因的缺失等也与集落类型无密切关系。即集落增殖快慢可能主要源于细胞毒性，而非TK基因的损伤状态，但尚待进一步的研究。

目录

前言

第一部分 TK6-E6细胞在TK基因突变试验分析中的应用

1前言

2材料与方法

3结果

4讨论

5小结

第二部分WTK1、TK6和TK6-E6三种人类淋巴母细胞在TK基因突变试验中的应用比较

1前言

2材料和方法

3结果

4讨论

5小结

第三部分TK基因突变试验——两类集落的比较

前言

Ⅰ.正常生长和缓慢生长突变集落在TK基因突变试验中的比较

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

Ⅱ.两类集落的核型分析

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

Ⅲ.杂合性丢失分析

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

Ⅳ.RT-PCR检测tk基因、survivin基因和grb2基因的改变

1材料和方法

2结果

4讨论

4小结

全文总结

参考文献

综述 TK基因突变试验研究进展

参考文献

致谢

声 明