青蒿琥酯对脂多糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响及机制探讨

摘要

肾小球系膜细胞(GMC)增殖是许多肾小球疾病常见的病理改变。GMC增殖可引起细胞外基质(ECM)过量生成和聚集，并最终导致肾小球硬化(GS)、肾脏纤维化及终末期肾功能衰竭。设法控制系膜细胞增殖对争取逆转肾小球损伤、防止肾脏疾病向慢性化演变具有重要意义。近年来研究表明青蒿素类药物药理学作用多样，可显著抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡，并且对皮肤瘢痕、肝脏纤维化组织等具有明显抗纤维化作用。本研究观察了青蒿琥酯(Art)对脂多糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响，并进一步从细胞周期、细胞凋亡及其调控蛋白表达等层面探讨青蒿琥酯抑制肾小球系膜细胞增殖的可能机制，旨在从细胞水平初步探讨青蒿琥酯治疗肾小球疾病的作用机制，为临床更好的将青蒿素类药物应用于预防、治疗肾小球硬化、肾脏纤维化提供实验依据。 方法： 1．应用体外细胞培养技术，培养大鼠肾小球系膜细胞(GMC)，选择脂多糖(LPS)作为诱导物。设立正常对照组、LPS对照组、青蒿琥酯不同浓度组进行实验。 2．应用MTI、法观察青蒿琥酯对GMC增殖的影响，计算药物抑制率，绘制细胞生长曲线；免疫细胞化学染色结合计算机图文分析系统检测增殖细胞核抗原PCNA的表达情况。 3．应用流式细胞术检测青蒿琥酯对GMC细胞周期的影响；免疫细胞化学染色结合计算机图文分析系统检测细胞周期素激酶抑制剂P27蛋白的表达情况。 4．通过形态学观察、荧光染色及流式细胞术检测青蒿琥酯对GMC凋 亡的诱导作用；免疫细胞化学染色结合计算机图文分析系统检测凋亡蛋白Bcl-2的表达情况。结果： 1． MTI实验显示：与正常对照组相比，LPS具有明显诱导GMC增殖的作用(P<0.05或P<0.01)；青蒿琥酯作用24、48、72h，GMC增殖水平均可受到抑制(P<0.05或P<0.01)，且随药物浓度增大、作 用时间延长，抑制作用增强，高浓度组(60mg/L)72h抑制率可达51.18％。细胞PCNA免疫化学染色结果显示，LPS可上调PCNA表达(P<0.01)，而青蒿琥酯作用48h，细胞PCNA表达明显下降(P<0.05或P<0.01)，且高浓度组作用强于低浓度组(P<0.01)。 2．对细胞周期的分析发现，L2S具有诱导细胞进入S期的作用；而青蒿琥酯干预48h后，细胞有丝分裂被阻滞于Go期，S期细胞比例下降，Go期细胞比例增加(P<0.05或P<0.01)。P27免疫细胞化学染 色结果显示，LPS组P27表达下降(P<0.01)，青蒿琥酯作用48h，P27表达明显上调(P<0.01)，且高浓度组作用强于低浓度组(P<0.01)。 3．青蒿琥酯作用48h后，倒置相差显微镜下观察可见细胞形态发生明显改变，HE染色可见凋亡细胞产生，DAPI着染可见细胞核固缩、凋亡小体形成。流式细胞术检测发现亚二倍体凋亡峰形成，60mg/L青蒿琥酯作用48h细胞凋亡率可达34.3％。Bcl-2免疫细胞化学染色结果显示，青蒿琥酯可明显下调Bcl-2的表达(P<0.05或：P<0.01)， 且高浓度组作用强于低浓度组(P<0.01)。 结论： 1．青蒿琥酯对LPS诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖具有明显的抑制作用，且该抑制作用呈时间、剂量依赖性。 2．青蒿琥酯对GMC增殖的抑制作用机制，可能与阻滞细胞周期、促进细胞凋亡有关；在分子层面则可能与调控增殖细胞核抗原PCNA、细胞周期素激酶抑制剂：P27和凋亡蛋白Bc1-2的表达有关。 3．本研究提示青蒿琥酯药物具有延缓肾小球硬化、肾脏纤维化的作用。

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综述青蒿素类药物对细胞凋亡增殖作用研究进展

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