间变性大细胞淋巴瘤中间变性淋巴瘤激酶、survivin及mTOR信号通路的研究及其临床意义

摘要

【背景和目的】间变性大细胞淋巴瘤是一种较少见的、T或null细胞性非霍奇金淋巴瘤。约60％～85％的ALCL病例表达ALK融合蛋白。ALK可通过激活PLC-γ、JAK/STAT、PI3K/AKT等信号通路，引起细胞生长和凋亡调控失调导致肿瘤发生。在JAK/STAT通路中，活化STAT3可诱导抗凋亡基因bcl-X<,L>及 survivin的表达。survivin是抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的一种蛋白。survivin的表达与肿瘤侵袭性和不良预后有关。可用于研究肿瘤发病、诊断、治疗及预后判断。在PI3K/AKT通路中，活化的AKT激活mTOR蛋白，调节mRNA的翻译。mTOR通过激活其下游蛋白4E-BPl和p70S6K促进蛋白翻译和合成。现已发现，许多肿瘤伴有mTOR通路上调。 本研究的第一部分通过检测81例系统性ALCL病例中ALK、survivin及磷酸化的AKT、mTOR、4E-BP1、p70S6K的表达，并结合ALCL组织学形态、免疫表型、临床病理特征及预后，探讨它们在ALCL中表达的临床病理意义及相互关系，比较它们的表达与ALCL病例预后的关系。 本研究的第二部分通过检测ALK阳性细胞株中mTOR通路中磷酸化的4E-BP1、p70S6K的表达，并用rapamycin抑制mTOR蛋白激酶活性，观察ALK阳性细胞株磷酸化的4E-BP1、p70S6K表达的变化，以及细胞株的生长是否受到抑制，探讨ALK激活mTOR通路是否是ALK阳性ALCL可能的分子发病机制。 【材料和方法】本研究的第一部分收集了四川大学华西医院81例系统性ALCL的临床资料并随访。组织学分型采用2001年版WHO关于淋巴造血组织肿瘤的分类，免疫组化染色采用EnVision法，第一抗体为ALK1、CD30、CD3、CD45RO、CD20、CD79a、EMA、granzyme B、TIA1、survivin、磷酸化的AKT、mTOR、4E-BP1及p70S6K。本研究的第二部分应用Western blot法，检测ALK阳性细胞株中磷酸化的4E-BP1及p70S6K的表达情况；并用 rapamycin干预ALK阳性细胞株，检测干预前、后磷酸化的4E-BP1、p70S6K在ALK阳性细胞株中表达的变化；应用MTT法检测干预后细胞的生长情况；应用流式细胞仪检测干预后细胞凋亡和细胞周期的改变。 【结果】组织学上，81例ALCL中普通型62例(76.5％)、淋巴组织细胞型2例(2.5％)和小细胞型17例(21％)。所有细胞均表达CD30，55例(67.9％)CD3/CD45RO阳性，26例(32.1％)CD3、CD40RO、CD20、CD79a均阴性，65例(80.2％)TIA1/granzyme B阳性，49例(60.5％)EMA阳性。Ki-67指数为1％～90％，54例(66.7％)为低表达病例(表达率≤60％)，27例(33.3％)为高表达病例(表达率>60％)。ALK1在81例ALCL中51例(63％)阳性，其中，核+浆阳性39例(占ALK阳性病例的76.5％)，浆阳性12例(占ALK阳性病例的23.5％)。ALK表达与ALCL的组织学变型、免疫学表型均不相关(p>0.05)，ALK表达模式与ALCL组织学变型无关(p>0.05)。 在77例行survivin免疫组化染色病例中，44例(57.1％)为survivin低表达病例(表达率≤30％)，33例(42.9％)为高表达病例(表达率>30％)。survivin不同表达状况与组织学变型、免疫学表型及ALK的表达无关(p>0.05)，与Ki-67表达有关(p<0.05)。 在71例行磷酸化的AKT、mTOR、4E-BP1及p70S6K免疫组化染色病例中，磷酸化AKT阳性54例(76.1％)，为核+浆或浆阳性。磷酸化AKT表达与ALK表达相关(p<0.05)；磷酸化roTOR阳性57例(80.3％)，为浆阳性。磷酸化mTOR表达与ALK、磷酸化AKT表达相关(p<0.05)；磷酸化4E-BP1阳性64例(90.1％)，磷酸化p70S6K阳性66例(93％)，均为核+浆或浆阳性，磷酸化4E-BP1及磷酸化p70S6K表达与磷酸化mTOR表达相关(p<0.05)，与ALK、磷酸化AKT表达无关(p>0.05)。本组81例中，男性61例，女性20例，男女比例3.05：1，年龄范围4～74岁，平均年龄33.0±18.91岁。ALK阳性病例的年龄显著小于阴性病例(p<0.05)。ALK阳性病例的5年生存率为50％，ALK阴性病例的2年生存率为20％，两者生存率曲线有显著性差异(p<0.05)。survivin低表达病人的5年存活率为55％，高表达的5年生存率为20％，两者生存率曲线差异显著(p<0.05)，同时，在ALK阳性病例中，survivin高表达预后较低表达的差(p<0.05)。而磷酸化的AKT、mTOR、4E-BP1及p70S6K的表达均与病人的性别、年龄及预后无关(p>0.05)Western blot法检测发现ALK阳性ALCL细胞株Karpas299及BaF3/ATIC-ALK中磷酸化的4E-BP1及p70S6K的表达明显多于无ALK蛋白表达的BaF3细胞。rapamycin干预后，Karpas299及BaF3/ATIC-ALK中磷酸化的4E-BP1及p70S6K的表达明显下降，rapamycin对ALK阳性细胞株的生长、增殖抑制作用明显，流式细胞术检测发现Karpas299及BaF3/ATIC-ALK中出现显著的G1期停滞及凋亡。 【结论】 1.ALK阳性与ALK阴性ALCL在临床病理上的不同，提示两者可能为不同的淋巴瘤实体； 2.survivin高表达的ALCL病例预后差，survivin表达与ALK不相关、是一个独立的预后指标； 3.磷酸化的AKT、mTOR、4E-BP1和p70S6K在ALCL病例中均表达，在ALK阳性病例中表达率高于阴性病例，磷酸化的AKT、mTOR表达与ALK表达相关，提示在ALK阳性ALCL中存在AKT/mTOR通路的激活； 4.ALK阳性ALCL中ALK激酶激活了mTOR通路；抑制mTOR活性，可抑制ALK阳性细胞株肿瘤性生长，提示ALK激活其下游的mTOR通路可能是ALCL发生的分子机理。 5.rapamycin对ALK阳性细胞株的生长增殖有抑制作用，提示rapamycin可能成为新的治疗ALK阳性肿瘤的药物。

目录

论文说明：缩略词表

声明

摘要

第一部分间变性大细胞淋巴瘤中间变性淋巴瘤激酶、survivin、mTOR及其相关蛋白的表达及其临床意义

前 言

1.材料和方法

2.结 果

3讨论

结 论

附 图1

附 图2

参考文献

第二部分ALK激活mTOR信号传导路径及抑制mTOR活性诱导ALK阳性细胞株凋亡的研究

前言

1.材料和方法

2.结 果

3讨论

结 论

参考文献

文献综述 mTOR信号通路与淋巴造血肿瘤

致谢