矮牵牛花香基因BSMT3cDNA克隆与原核表达

摘要

对矮牵牛的核型研究结果证实矮牵牛体细胞染色体核型公式为2n=14=8m+6sm，无随体现象，核型为2A型，属于中度对称核型。以矮牵牛花瓣总RNA为模板，经RT-PCR扩增得到大小约1100bp的特异PCR产物，与预期大小一致。将RT-PCR产物与pMD18-T载体连接后转化DH5a感受态细胞，经菌落PCR和酶切鉴定分析，筛选有目的片段插入的重组质粒，命名为pBSMT。含目的基因片断的pBSMT质粒经测序，其全长为1105bp，最大开放阅读框(ORF)为1074bp，编码357个氨基酸残基。在GenBank数据库中进行同源比较，结果表明它与已报道的矮牵牛BSMT序列有较大的差异，并在GenBank中登记(登记号：DQ494491)。采用DNAtools 5.1、DNAman5.1进行对新序列编码的蛋白质组成分析和与已知茄科花香基因氨基酸序列作同源性比较并构建系统树。 分别用EcoRI+SalI酶切pBSMT质粒和pGEX4T-1质粒，将回收得到的目的片段和载体连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于LA培养基上。选取PCR阳性的菌落，提取质粒，用EcoRI+SalI酶切，酶切片断大小与预期值一致，再进一步用BamHI酶切质粒，出现预期的680 bp小带，故所切质粒为正确质粒，命名为pGBSMT。提取pGBSMT质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，筛选出菌落后，接种于LA培养基，培养至OD<,600>=0.9，加入IPTG至终浓度0.1mmol/L，继续培养3-4小时后收集菌体，制备融合蛋白样品，经SDS-PAGE表达样品在66.6KDa处出现明显蛋白带：正是GST和BSMT3分子量之和。重组蛋白经GST层析亲合柱处理后，SDS-PAGE检测结果表明BSMT融合蛋白未发生降解，大小任为66.6KDa，纯度较高。用收集的融合蛋白免疫日本大耳白家兔，采兔耳静脉血用间接ELISA方法测定其效价，测定结果为1：12800。制备矮牵牛各组织石蜡切片，进行免疫组织化学定位，结果显示主要在花冠和花筒有BSMT3的表达。本研究为BSMT3的真核表达奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

前言

声明

第一章矮牵牛花香基因BSMTcDNA的克隆与序列分析

1引言

2材料和方法

2.1材料

2.2方法

3结果

3.1矮牵牛的核型分析

3.2矮牵牛BSMT cDNA的RT-PCR

3.2BSMT片段的克隆

3.3 cDNA片段序列分析

3.4同源性分析与系统树构建

4讨论

4.1矮牵牛核型分析

4.2矮牵牛BSMT3 cDNA的序列分析

4.3植物花香基因编码的酶

第二章矮牵牛BSMT3的原核表达与抗体制备

1引言

2材料和方法

2.1材料

2.2方法

3结果

3.1原核表达载体的构建

3.2 BSMT3 cDNA在大肠杆菌中表达产物的SDS-PAGE

3.3重组子表达的融合蛋白回收

3.4兔抗BSMT血清的滴度测定

3.5矮牵牛BSMT在不同组织的免疫定位

4讨论

4.1原核表达质粒载体的选择

4.2原核表达重组质粒的筛选

4.3表达产物的分析

4.4免疫组织化学定位分析

总结

参考文献

文献综述：植物的花香成分及花香基因研究现状

在读期间发表论文

致谢