PNAS-4基因的克隆，功能及其抗肿瘤作用的研究

摘要

恶性肿瘤对人类的健康和生命威胁极大。随着二十一世纪的到来，肿瘤已经成为人类疾病的第一位死亡原因。虽然包括放疗、化疗和手术治疗等传统的肿瘤治疗方法取得了一定的成效，但其日益显现的局限性促使人们寻找新的肿瘤治疗方法。随着分子生物学的发展和对肿瘤分子机制认识的深入，基因治疗为肿瘤的根本性治愈提供了希望。自从上世纪90年代以来，全世界的科学家在肿瘤基因治疗领域做出了许多卓越的贡献，使得肿瘤的基因治疗得于蓬勃快速的发展，但至今为止，仍然存在许多需要解决的问题。其中急需解决的问题是：目前有治疗价值的基因太少，能抑制肿瘤生长的基因为数不多，对目的基因的信号转导及其相互作用蛋白之间的关系还不完全明确。 细胞凋亡是一种在特定时空主动发生的、受基因严密调控的细胞死亡现象。分子肿瘤学研究发现细胞凋亡与肿瘤的发生、发展以及与肿瘤治疗中的细胞死亡有着密切的关系。肿瘤的发生主要是由于细胞内癌基因、抑癌基因及其他相关调节基因突变，从而使细胞基因组失去稳定性，最终导致肿瘤的发生。以选择性地诱导肿瘤细胞凋亡为目标的肿瘤基因治疗已经成为治疗恶性肿瘤的主要策略之一，而其中最诱人的策略便是以诱导细胞凋亡为目标的基因治疗。 随着2004年人类基因组测序计划的完成，人类基因组计划已进入功能基因组时代，其目的在于克隆新基因并阐明这些基因的功能及其基因间的相互作用关系。这为发掘和探索更多的新的凋亡相关基因提供了便利条件，也为包括肿瘤在内的众多疾病提供更多的治疗靶点或治疗基因。PNAS-4基因是NIH在大规模测序中鉴定的新基因之一。有研究报道：PNAS-4是-个DNA损伤的早期反应蛋白，它的过表达能显著引起人骨肉瘤U2OS细胞的凋亡，并有望成为一个新的肿瘤治疗基因，但是其具体的作用机制仍不清楚。为了更加详细深入地研究PNAS-4基因的功能及其机制。本文分离了爪蟾、小鼠和的人PNAS-4基因，并分别从胚胎发育、小鼠肿瘤基因治疗及其促进细胞凋亡的机制进行初步的研究，结果如下： 1．分离了爪蟾的PNAS-4．(xPNAS-4)基因，并对其的序列特征进行了生物信息学分析，亚细胞定位实验发现xPNAS-4主要定位于胞浆的核膜周围，发育表达谱分析发现xPNAS-4为一母性遗传基因，在发育的各个时期均有表达，表达部位主要在头、心脏和背部神经；将其体外转录的mRNA注射到爪蟾或斑马鱼早期胚胎中发现，mRNA的过表达能够导致爪蟾眼睛变小，色素减少，斑马鱼胚胎眼睛大小不对称或独眼，严重者可引起脊索弯曲。 2．分离了小鼠的PNAS-4(mPNAS-4)基因，体外细胞增殖活性实验(MTT)发现，mPNAS-4基因的过表达能够抑制小鼠肺癌LL2和结肠癌CT26细胞的增殖，PI染色和DNA片段化分析表明，mPNAS-4基因的过表达能够促进LL2和CT26细胞的凋亡。体内的抑瘤性实验表明，瘤内或尾静脉注射脂质体包裹的pcDNA3.1-mPNAS-4真核表达质粒能够显著抑制肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠的生存期。 3．分离了人的PNAS-4基因，转染人的肺癌A549细胞发现，过表达PNAS-4蛋白能将细胞周期阻断于S期并促进A549细胞的凋亡，Westernblotting分析表明，PNAS-4蛋白的过表达能够导致细胞线粒体中的细胞色素C释放到胞浆，诱导p21、E2F1和Bax的表达上调，PCNA、HSP70和Bcl-2的表达下调以及Bid和caspase 3活性片段的产生。而p53基本无变化，使用p53蛋白的抑制剂Pft-a不能逆转PNAS-4蛋白所导致的细胞凋亡。 我们的研究首次分离了爪蟾和小鼠的PNAS-4基因，探索了PNAS-4蛋白在胚胎发育，小鼠肿瘤基因治疗及其抑制肿瘤生长的分子机制，为以后PNAS-4基因的功能机制研究和肿瘤基因治疗的应用研究奠定了一定的基础。

目录

声明

摘要

技术路线

前 言

第一部分 非洲爪蟾PNAS-4基因的克隆，生物信息学分析，亚细胞定位及其对胚胎发育影响的实验研究

1材料与方法

2结 果

第二部分 小鼠PNAS-4基因分离、特征和过表达抑制肿瘤的生长的实验研究

1材料与方法

2结 果

第三部分 人HPNAS-4基因捉进A549肿瘤细胞凋亡的机理研究

1材料和方法

2结 果

全文讨论

结 论

参考文献

文献综述 细胞凋亡与肿瘤基因治疗

1细胞凋亡的概念

2细胞凋亡的生物学特征

3细胞凋亡过程机理

4细胞凋亡相关分子

5细胞凋亡的信号转导通路

6细胞凋亡相关基因与肿瘤

7结语

参考文献

发表论文

致 谢