钙离子载体A23187诱导急性髓性白血病细胞分化为树突状细胞的研究

摘要

背景和目的: 儿童急性髓性白血病(AML)治疗效果差，容易复发，复发的根源为体内微小残留病(MRD)的存在，而MRD的根除需要有效启动T细胞介导的细胞毒免疫反应。然而，AML白血病细胞MHC、共刺激分子和黏附分子表达量低或不表达，不能将白血病抗原有效地提呈给T细胞从而启动机体特异性抗白血病免疫应答。因此，清除MRD而达到防止复发和根治白血病的关键是将白血病抗原有效地提呈给T细胞并激活T细胞介导的抗白血病免疫应答。树突状细胞(DC)是目前功能最强，也是唯一可直接活化初始型T细胞的抗原提呈细胞，其独特的功能在肿瘤免疫中备受关注。用细胞因子(CK)体外诱导培养DC的方法现己非常成熟，但存在代价昂贵、培养时间长、易污染以及某些急性髓性白血病不能诱导生成DC等缺点。近年发现钙动员可快速诱导外周血单个核细胞、CD34<'+>造血祖细胞等正常细胞分化为DC。 本实验第一部分用钙离子载体A23187将对多种细胞因子诱导不敏感的髓系白血病细胞株HL-60细胞快速诱导分化为成熟DC，并对其形态学、免疫表型及刺激T淋巴细胞增殖功能进行分析；第二部分引入蛋白激酶C(PKC)特异性抑制剂Bis-1，初步探讨细胞内PKC信号途径在A23187诱导HL-60细胞向DC分化过程中的作用，了解细胞内钙信号转导途径与PKC信号途径是否存在相互应答；第三部分探讨临床AML患儿不同FAB亚型的原代白血病细胞在体外被钙离子载体A23187诱导生成DC的可能性。白血病来源的DC不仅携带着白血病细胞的全部抗原信息，而且不会发生排斥反应，为临床彻底清除AML患者体内的微小残留病提供了一条前景乐观的途径。 方法: 1．用钙离子载体A23187或联合rhIFN-γ诱导髓系白血病细胞株HL-60细胞分化为DC，用倒置显微镜和扫描电镜观察其形态学特征，流式细胞仪检测其免疫表型，混合淋巴细胞反应检测其刺激T淋巴细胞的能力。 2．用蛋白激酶C特异性抑制剂Bis-1预先处理HL-60细胞再用A23187处理，比较先经Bis-1处理的HL-60细胞与单用A23187处理的HL-60细胞在形态学、免疫表型及刺激T细胞增殖能力方面的异同。 3．分离12例初诊急性髓性白血病患儿的骨髓或外周血单个核细胞，用A23187培养3～4天，进行形态学、免疫表型及功能的检测和分析。 结果: 1．HL-60细胞加入适量A23187(180ng/ml)诱导20h后，即可出现细胞表面树状突起，且树突状细胞表面特异性成熟标志抗原CD83、共刺激分子CD80、CD86表达升高，分别为：(42.60±7.90)％、(8.59±1.08)％、(36.80±5.42)％；培养48h，CD83分子表达开始降低；培养72h，可获得DC的典型形态，CD80、CD86分子表达持续升高。同种异体混合淋巴细胞反应检测经A23187诱生的DC可明显刺激同种异体T淋巴细胞增殖。 2．单用rhIFN-γ (1000U/ml)诱导HL-60细胞，96h细胞形态仍无明显变化，细胞表面CD83分子及共刺激分子CD86、CD80的表达均较弱，刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力与对照组比较无统计学差异(P值>0.05)。A23187(180ng/ml)联合rhIFN-γ (1000U/ml)诱导的HL-60细胞表面CD83、CD80、CD86表达以及刺激T细胞增殖能力有增高趋势，但与单用A23187相比差异无统计学意义。 3．用PKC特异性抑制剂Bis-1预先处理再予A23187处理的HL-60细胞其形态、免疫表型及刺激T淋巴细胞增殖的能力均受到不同程度的抑制，细胞表面DC特异抗原CD83、CD80、CD86分子的阳性表达率分别为(13.23±2.15)％、(9.70±1.69)％、(23.37±7.50)％，与单用A23187处理的HL-60细胞比较，有统计学差异(P值均<0.05)。 4．12例AML患者中有10例患者(其中M<,1>型1例、M<,2>型1例、M<,3>型2例、M<,4>型1例、M<,5>型5例)的白血病细胞经A23187培养3～4d后出现符合典型DC形态的细胞，但有2例AML患者白血病细胞的形态始终无明显变化；12例AML患者中有10例患者的白血病细胞经A23187诱导后出现CD83、CD80、CD86分子表达升高：培养前细胞CD83、CD80、CD86分子的阳性表达率分别为(2.06±0.95)％、(2.24±1.05)％、(3.61±1.43)％，经A23187诱导后，CD83、CD80、CD86分子表达均明显增高，分别为(28.19±8.21)％、(45.32±9.90)％、(58.67±12.17)％，与培养前相比有统计学差异(P值均<0.05)。12例AML患者中有10例患者的白血病细胞经A23187诱导后刺激T淋巴细胞增殖的能力明显增强。此外，AML患儿M<,4>/M<,5>型与非M<,4>/M<,5>型来源的AML细胞在A23187诱导前后免疫表型比较发现，M<,4>/M<,5>型的白血病细胞更易诱导生成DC样细胞，其细胞表面成熟DC免疫标记CD83、共刺激分子CD80、CD86的表达率均明显高于非M<,4>/M<,5>来源的DC，差异有统计学意义(P值<0.05)。外周血与骨髓来源的白血病细胞诱生为DC的表面免疫标志的表达率的差异无统计学意义(P值>0.05)。 结论: 1．钙离子载体A23187可使急性髓细胞白血病细胞株HL-60细胞快速诱导分化为成熟DC。 2．单用IFN-γ处理HL-60细胞，未能获得DC样细胞；联合CI-A23187诱导HL-60细胞可获得更成熟、刺激T细胞增殖能力更强的DC。 3．PKC特异性抑制剂Bis-1在A23187诱导HL-60细胞分化为DC的过程中起抑制作用，表明PKC信号路径参与A23187诱导AML白血病细胞分化为DC的过程。 4．多数AML患者的白血病细胞经A23187诱导3～4d分化为DC，部分病例不能诱导成DC，表明AML因具有生物学异质性而对同一种诱导剂的反应不同。M<,4>/M<,5>型白血病细胞体外培养易生成具有树突状细胞形态、特征的细胞。AML患儿外周血和骨髓样本来源的DC表面标志表达率无统计学差异，对于外周血白血病细胞比率高的病人，可采集外周血样本来取代骨髓样本诱导白血病DC。

目录

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分 钙离子载体A23187诱导HL-60细胞分化为树突状细胞的研究

第二部分 蛋白激酶C信号途径在A23187诱导HL-60细胞分化为树突状细胞中的作用

第三部分 钙离子载体A23187诱导急性髓性白血病细胞分化为树突状细胞

全文小结

参考文献

综述 树突状细胞的诱导分化及其在肿瘤免疫治疗中的作用

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