CD80共刺激分子单独表达诱导免疫耐受机理初探

摘要

研究背景：特异性抑制排斥反应，诱导免疫耐受是器官移植面临的主要挑战之一。T细胞作为免疫反应的主要细胞，无论对免疫排斥还是免疫耐受都起到关键作用。T细胞活化需要MHC复合体提供第一信号及共刺激分子提供第二信号。CD80/CD86是重要的共刺激分子，通过与受体CD28/CTLA-4结合，调控T细胞活化及分化。CD80/CD86作为同源分子，一直被认为功能相似。但最近研究发现，二者功能不尽相同。对CD80/CD86与CD28/CTIA-4系统的生物物理学研究表明，CD80能与CTLA-4形成更稳定的结合，有体内外实验证实CD80能抑制T细胞增殖，而CD86不能，提示CD80很可能主要通过CTLA-4传递抑制信号，抑制免疫反应。 皮肤作为免疫原性最强的器官，常规异基因移植很难避免排斥反应。但有研究显示，培养的小鼠皮肤角朊细胞同种异体移植后急性排斥反应不明显，角朊细胞能被CD8<'+>T细胞识别，但不被排斥。另有研究发现少量自体角朊细胞与同种异体甚至异种角朊细胞混合培养后移植，不发生明显的急性排斥，慢性排斥也不明显，移植皮片能长期存活。 本研究受国家973计划(2003CB15504)、国家自然科学基金(30371355)和教育部博士点基金(SRFDP 2002061 0088)资助理不明。我们前期实验从基因和蛋白两个层面证实培养的小鼠角朊细胞能单独表达CD80蛋白，不表达CD86蛋白。实验中还发现培养的小鼠心肌细胞也能单独表达CD80蛋白。本研究进一步探讨培养的近交系小鼠角朊细胞膜片诱导免疫低反应现象与角朊细胞单独表达CD80共刺激分子的关系，并对同样单独表达CD80分子的小鼠心肌细胞也进行了免疫学相关检测，用两个不同细胞模型来验证CD80单独表达诱导免疫耐受的可能性。 研究方法：分别培养乳鼠角朊细胞及心肌细胞，通过免疫荧光、RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain：reaction)检测培养细胞CD80/CD86表达情况。将培养的角朊细胞和心肌细胞分别与预活化同种异体细胞毒性淋巴细胞(cytotoxicity T lymphocyte，CTL)共培养，检测杀伤率，另用不表达CD80分子或表达CD80但加入anti-CD80抗体的相同细胞作对照。为检测自体角朊细胞在免疫耐受中有何作用，以培养的角朊细胞为调节细胞，以不同比例加入同基因和同种异基因脾细胞混合培养体系中，用MTT法测淋巴细胞增殖率。同样用不表达CD80分子或表达CD80但加入anti-CD80抗体的相同细胞作对照。为检测CD80是否通过CTLA-4途径影响免疫反应，在上述表达CD80的细胞反应体系中，均加入anti-CTIA-4抗体，封闭CTLA-4通路。 结果：乳鼠角朊细胞培养1天后检测，抗CD80抗体未显色。培养7天后，抗CD80抗体显色明显加强，形态规则，胞核明显。相同条件下检测CD86表达，在培养1、7天时均未发现抗CD86抗体着色。乳鼠心肌细胞培养10天后增殖心肌细胞高表达CD80蛋白，而CD86蛋白检测不到。RT-PCR显示培养10天心肌细胞CD80 mRNA表达强度与β-actin相似，但CD86 mRNA表达很低。 CTL杀伤实验中，培养7天同种异体角朊细胞杀伤率在各个E：T比时均低于培养1天角朊细胞。用anti-CD80抗体封闭CD80与anti-CTIA-4抗体封闭CTLA-4后，CTL杀伤率均上升，7天和1天培养的角朊细胞杀伤率相近。培养10天的同种异体心肌细胞在E：T从3：1到30：1时，杀伤率为6.36％到39.66％，加入anti-CD80和anti-CTIA-4抗体后，杀伤率几乎增加了1倍。 单向混合淋巴细胞增殖实验结果显示，培养7天自体角朊细胞能抑制单向混合淋巴细胞增殖反应(mixed lymphacyte：reaction，MLR)，并随自体角朊细胞的增加，抑制增强，在E：T：auto-KC=1：1：1.5时到达最大效应。同种异体角朊细胞则不能抑制MLR，相反有促进作用。培养1天的角朊细胞也不能抑制MLR，其MLR增殖程度与未加角朊细胞MLR增殖程度相似略有增加。用抗体封闭培养7天角朊细胞CD80后，抑制作用消失，但仍低于培养1天角朊细胞。anti-CTIA-4阻断CD80与CTLA-4结合，培养7天自体角朊细胞抑制作用也消失，甚至随自体角朊细胞数量增加，有促进MLR的趋势。 结论：本实验结果提示，角朊细胞和心肌细胞等实体细胞在一定条件下能单独表达CD80，与自身MHC分子配合，可成为一种有效的调节性抗原提呈细胞(regulatory antigen present cell，rAPC)，对免疫反应产生影响。CD80分子通过CTLA-4可抑制抗原特异性CTL杀伤。自体细胞还能通过CTLA-4抑制淋巴细胞的增殖反应。这种抑制涉及MHC分子。但本实验尚未证实CD80是通过那一类细胞上的CTLA-4产生效应，同时还需进一步研究CD80与自身MHC分子共同作用抑制淋巴细胞增殖的具体机制。

目录

论文说明：主要中英文对照表

声明

前言

第一部分角朊细胞培养及CD80分子表达检测

引言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

附图

第二部分角朊细胞单独表达CD80对免疫反应的影响

引言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分培养的乳鼠心肌细胞单独表达CD80蛋白对CTL杀伤功能的影响

引言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第四部分综述：CD80/CD86及其受体CD28/CTLA-4的结构及功能

全文总结

个人简历

致谢