决明子胰蛋白酶抑制剂COTI的分离纯化及性质研究

摘要

天然的蛋白酶抑制剂是一类分子量较小，稳定性好，对蛋白酶活性有抑制作用的蛋白质或多肽，广泛存在于动物、植物及微生物中，尤其在植物贮存器官种子中，蛋白酶抑制剂含量常高达总蛋白的10％。它以类似底物形式与蛋白酶活性部位或变构部位结合，形成稳定的酶-抑制剂复合物，调节生物体内蛋白酶活性，阻止不良的蛋白水解。植物蛋白酶抑制剂已成为研究与蛋白代谢相关的医药及生物学的强有力的工具，在植物抗虫基因工程及疾病控制方面占有十分突出的地位。 本论文从决明种子中分离纯化得到胰蛋白酶抑制剂COTI(Cassia obtusifolia L.seeds trypsin inhibitor)，并对其进行了部分性质研究。 豆科植物决明(Cassia obtusifolia L.)的成熟种子，研磨粉碎后经水两次抽提，65℃热变性，35％～65％硫酸铵分部盐析等步骤，得到抑制剂粗提物。 进一步利用trypsin-sepharose-4B亲和层析和Scphadcx G-75凝胶过滤，最后从粗提液中分离纯化得到其中具有活性的胰蛋白酶抑制剂(COTI)，SDS-PAGE检测显示为一条多肽链，其近似分子量为19KD：热稳定性实验显示COTI在100℃水浴条件80min后仍可以保持部分的抑制活性，具有极高的热稳定性。变性剂二硫苏糖醇(DTT)37℃处理120min后，COTI仍具有约50％的活性，COTI存在活性下降的现象说明了二硫键对于维系COTI的活性中心起到了很重要的作用，但COTI仍保留了部分活性，是一种稳定性好的蛋白酶抑制剂。 抑制动力学实验证明：COTI抑制类型为竞争性抑制，抑制常数Ki测得为5.091×10<'-8>mol/L。 将纯化的COTI对新西兰雄兔进行多次免疫制备出免疫特异性强、效价高的抗血清。双向免疫扩散呈现一条清晰的沉淀线，确定抗血清效价为1：64，免疫印迹实验表明纯化的胰蛋白酶抑制剂免疫杂交带在19KD处。 COTI对菜青虫幼虫肠道提取物胰蛋白酶活性抑制实验，及油菜叶(经含COTI缓冲液浸泡过)饲喂菜青虫实验，引起菜青虫体重明显下降，并导致其部分死亡的结果显示，说明COTI对菜青虫生长具有明显的抑制作用，为进一步研究植物蛋白酶抑制剂抗虫、抗病等生理活动提供新的参考价值和基础依据。

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文摘

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论文说明：图表目录

声明

引言

1 材料与仪器

2 方法

2.1 胰蛋白酶抑制剂的分离纯化

2.1.1固相化胰蛋白酶亲和柱制备

2.1.2粗提物的制备

2.1.3抑制剂的分离纯化

2.2 胰蛋白酶抑制剂活性的测定

2.2.1明胶-PAGE活性电泳

2.2.2 BAPNA法

2.3 COTI纯品浓度测定

2.4 SDS-PAGE测定分子量

2.5 COTI的热稳定性

2.6变性剂DTT对COTI活性的影响

2.7 COTI粗品、纯品及BBI抑制活性的比较

2.8 COTI抑制类型的确定及抑制常数(Ki)的测定

2.9抗血清的制备和检测

2.9.1佐剂的制备

2.9.2抗血清的制备和效价的测定

2.9.3免疫印迹

2.10 COTI对菜青虫生长抑制作用

2.10.1饲喂试验

2.10.2活性电泳分析回收的浸泡后油菜叶片上存在的COTI

2.10.3幼虫肠道提取物制备及提取物丝氨酸蛋白酶活力测定

2.10.4 COTI对幼虫肠道提取物丝氨酸蛋白酶活力的抑制作用

3 结果

3.1 COTI的分离纯化

3.1.1明胶-PAGE活性电泳

3.2 COTI纯品浓度测定

3.3 SDS-PAGE测定分子量

3.4 COTI的热稳定性

3.5变性剂DTT对COTI活性的影响

3.6 COTI纯品、粗品与BBI抑制活性比较

3.7 COTI抑制类型的确定及抑制常数(Ki)的测定

3.8 COTI抗血清的制备及Western blotting检测

3.8.1抗血清效价的测定

3.8.2抗血清特异性检测

3.9 COTI对菜青虫生长抑制作用

3.9.1浸泡含COTI缓冲液的新鲜油菜叶片饲喂幼虫后，影响幼虫生长

3.9.2回收的浸泡后叶片上存在的COTI抑制剂活性分析

3.9.3幼虫肠道提取物丝氨酸蛋白酶活力及COTI抑制作用分析

4 讨论

4.1 COTI的分离纯化

4.2明胶-PAGE活性电泳

4.3 COTI的热稳定性

4.4变性剂DTT对COTI活性的影响

4.5 COTI抑制类型及抑制常数(Ki)

4.6 COTI抗血清的制备及Western blotting

4.7 COTI的抗虫性

5结论

参考文献

综述 植物类蛋白酶抑制剂的研究与运用

完成和发表论文情况

致谢