麻疯树苯丙氨酸解氨酶（Jatropha curcas L.phenylalanine ammonia-lyase）基因的克隆及功能研究

摘要

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)是苯丙烷类代谢途径的关键酶，催化苯丙氨酸转化为肉桂酸，促进黄酮、香豆素等次生代谢物的生成。麻疯树的这些次生代谢物具有多种生物学活性，具有广阔的运用前景。从麻疯树(Jatropha curcas L.)叶片中应用RT-PCR和RACE技术获得麻疯树PAL基因cDNA全序列，命名为JcPAL，登陆Genebank的序列号为DQ883805。序列分析表明：该cDNA全长2336bp，从第46 bp开始到2187 bp为开放阅读框，编码一个含713个氨基酸的蛋白质。多序列比对分析显示JcPAL的氨基酸序列与多种植物苯丙氨酸解氨酶的氨基酸序列有一定的同源性，其中与同科植物木薯的同源性最高，达到96％。通过生物信息学分析，发现JcPA三推测蛋白质的分子量约为77kDa，等电点为6.59，可能组成四个单体的聚合物。其单体的三维结构与欧芹的PAL非常相似。获得的JcPAL部分基因组序列显示，麻疯树苯丙氨酸解氨酶DNA序列包含一个内含子，位于JcPAL翻译起始密码子下游435bp处，这与其他植物苯丙氨酸解氨酶基因的结构类似。通过染色体步移技术，克隆出长度为1334bp的JcPAL基因起始密码子上游序列。采用在线预测和PLACE元件分析，结果显示其不仅具备典型的转录起始位点、CAAI、box、TATA box、A富含区，而且包含多种胁迫诱导元件，特别是在序列中发现一些苯丙氨酸解氨酶特有的元件。为了鉴定JcPAL基因的启动子元件，使用真核表达载体pBI121，分别构建了四个植物表达载体，为进一步研究JcPAL启动子的调控和元件分析奠定基础。 将编码麻疯树苯丙氨酸解氨酶(JcPAL)的片段定向克隆到pET-28a质粒，进行原核表达。经IPTG诱导后，SDS-PAGE检测发现麻疯树苯丙氨酸解氨酶在pET-28质粒中能正常表达，表达产物的分子量为80 kDa左右，与预测结果相符。考虑到低温促进可溶性蛋白的表达，采用20℃低温诱导培养20h，检测表达产物表明该片段表达的蛋白质存在可溶性蛋白形式，其表达量占菌体总蛋白的50％.以上。对可溶性蛋白进行活性分析，获到具有PAL活性的粗酶裂解液，粗酶的比活力为0.102μmol/min·g pro，低于红酵母PAL 和欧芹重组PAL 表达的比活力。表明麻疯树重组PAL活力不是很高，可能是一些实验条件没有得到优化。结果表明克隆重组的麻疯树PAL 基因通过表达质粒pET-28a在E.coli中能表达有催化功能的活力酶。 麻疯树幼苗在不同光照和温度条件下，使用乙烯利处理0h、6h、12h、24h和48h后，分别取处理不同时期的麻疯树叶片进行表达分析和PAL活性分析。结果说明：1)乙烯利对PAL活性具有诱导作用，其诱导不依赖于光照条件，但光照对乙烯利的诱导又具有一定的促进作用。乙烯利作用可以减弱高温对PAL表达的影响。2)高温能够延迟或者抑制PAL的表达。3)高温对PAL活性的这种抑制作用依赖于外界处理条件，即：没有光照和乙烯利处理时，PAL活性就没有变化。

目录

声明

第一章 麻疯树苯丙氨酸解氨酶的基因克隆及序列分析

前言

1.材料和方法

2.结果和分析

2.1 JcPAL cDNA基因全长的扩增与克隆

2.2麻疯树苯丙氨酸解氨酶基因组全长的克隆

2.3 JcPAL推测出的氨基酸序列及其分析

2.4 JcPAL蛋白结构预测和分析

2.5 JcPAL基因的进化分析

小结

参考文献

第二章 在光照、温度和激素的协同作用下，麻疯树叶苯丙氨酸解氨酶表达和活性的变化

前言

1.材料与方法

2.结果与分析

2.1 PCR产物电泳

2.2循环数对PCR产物灰度的影响

2.3不同诱导条件下，JcPAL基因的表达变化

2.4不同诱导方式对JcPAL活性的影响

3.讨论

小结

参考文献

第三章 麻疯树苯丙氨酸解氨酶基因在大肠杆菌中的表达

前言

1.材料与方法

2.结果与分析

2.1JcPAL基因编码片段的克隆与表达载体的构建

2.2基因片段的菌落PCR和酶切电泳检测

2.3 JcP4L表达产物的SDS-PAGE检测

2.4表达产物可溶性检测

2.5可溶性物质的活性检测

小结

参考文献

第四章 麻疯树苯丙氨酸解氨酶基因启动子克隆、分析及表达载体构建

前言

1材料和方法

2.结果与分析

2.1麻疯树总DNA的质量分析

2.2 JcPAL基因启动子片段的克隆

2.3 JcPAL基因启动子序列的功能元件分析

2.4JcPAL启动子缺失分析的表达载体构建和酶切鉴定

3.讨论

小结

参考文献

第五章 综述 苯丙氨酸解氨酶的研究进展

在读期间发表及待发表论文情况

致谢