可静脉注射新型纳米复合物载IL-18基因传递系统的研究

摘要

人类基因组计划的顺利完成，加速了功能基因的阐明和疾病相关基因的发现，也加深了人类从医学和生理学角度对自身的认识，使方兴未艾的基因治疗，成为21世纪生物医药领域的研究热点。 随着肿瘤发生发展的分子机制研究不断深入，人们逐渐认识到肿瘤的发生和发展是一个多因素、多步骤和多基因参与的复杂过程。其中细胞因子是一类由免疫细胞(淋巴细胞、单核巨唾细胞等)和相关细胞(成纤维细胞、内皮细胞等)产生的调节细胞功能的高活性、多功能蛋白质多肽分子，能激发、增强机体产生显著的抗肿瘤免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的，因此在肿瘤免疫基因治疗中已经被广泛用于实验治疗研究。但如果这类蛋白全身性给药，往往会因为外源性蛋白的免疫原性导致过于强烈的免疫反应而产生毒副反应。DNA疫苗由来自病原微生物或肿瘤细胞有编码基因的非复制型DNA质粒组成。将编码不同蛋白的质粒接种于体内，可导致机体T细胞和相应抗体对这些蛋白的应答，因而提供了一种特异性免疫手段。优点有：①没有导入可能与“减毒”疫苗相关的强毒力病毒的危险性；②易于大量制备，价格便宜；③可以干粉形式长期保存；④小剂量适当的基因构建于即可诱导保护性免疫；⑤使用一次即能产生长期免疫力。 虽然近20年来基因治疗取得了很大的发展，但当前基因治疗研究中还存在很多技术性的难题，其中之一就是治疗基因的有效传输。目前的基因传递系统主要包括病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体虽然具有比较高的转染效率，但是它们的生物安全性问题至今尚未得到很好的解决。非病毒载体安全性高，易于大规模生产，研究主要集中在脂质体和高分子载体系统上。这两种载体作为给药系统，在药剂学领域已经有了广泛的研究。脂质体主要由磷脂组成，生物相容性好，对所携带的遗传物质没有片断大小的限制，可以通过内吞和融合等作用方式进入细胞，转染效率相对较高，但稳定性较差和主要带正电荷限制了其在静脉注射中的应用。而高分子基因传递系统，也具有很好的生物相容性，很低的生物毒性，生物降解性的特点，且其生产成本低，稳定性高，便于结构修饰，是一类更具开发潜力的载体系统。本课题用聚阳离子多肽一多聚赖氨酸(PLL)与DNA形成缩合物，再采用复乳一溶剂挥发法制备PELGE为载体材料的纳米多聚复合物载药系统PPDs(polymeric-polycationic peptide-DNA，PPDs)，较为系统地研究了载基因的制备处方工艺条件，详尽地考察了其物理化学性质，体外转染能力及细胞毒性，并建立了小鼠肺转移肿瘤模型，用PPDs携带治疗基因mIL-18，进行了体内药效学研究。在此基础上，我们还对PPDs进行了叶酸修饰，提高了其对肿瘤细胞的靶向性。 首先，我们制备了非病毒表达载体，对合成的传递载体材料(PELGE)进行了细胞毒性评价，筛选出适合以后实验的材料，诣在将其应用于载基因纳米粒静脉注射。实验利用转化的大肠杆菌DH5-α分别扩增了需要的报告基因和治疗基因，按照试剂盒说明用阴离子交换树脂分离纯化了质粒DNA，采用紫外分光光度法测定了其含量，通过计算A<,260>/A<,280>的比值，证明其纯度符合要求；我们又采用琼脂糖凝胶电泳进一步考察了质粒DNA的纯度和构型，结果表明纯化产物的纯度和构型均符合要求。由载体材料PELGE的细胞毒性试验可以得出，在实验给药的浓度条件下，材料纳米粒对血管内皮细胞相容性最好，如静脉注射后被动浓积于肝脏，毒性也很小，宜于用于血管使用，即静脉注射。并且鉴于PELGE系列聚合物细胞毒性和血液相容性研究的综合考虑，我们选用材料PELGE73进行后面的实验。 随后，我们采用荧光分光光度法，利用荧光染料Hoechst 33258与DNA结合发出荧光的原理，建立了DNA的含量测定方法。我们通过琼脂糖凝胶电泳和zeta电位的检测，确定了PLL与DNA的最佳比例(1：1，w/w)和混合介质(葡萄糖注射液)，成功地用PLL缩合了质粒DNA，为下一步的包封做了必要的准备。我们采用复乳-溶剂挥发法，以粒径和多分散指数(PDI)以及包封率为指标，通过单因素试验筛选了处方工艺条件，以PELGE与PLL/DNA缩合物一起制备了PPDs。用筛选后的处方工艺条件制得的PPDs为较规则的圆球，平均粒径为150.92±9.04nm，PDI为0.15±0.01，zeta电位为-27.31±2.02 mV，包封率为87.99±1.61％。DNA在制备过程中能保持其完整性，制备成PPDs后能有效抵抗核酸酶的降解，质量优良。对PPDs载体系统物理化学性质的进一步考察表明了，该种多聚复合NP制备的过程中加入了PLL，不仅能有效压缩DNA，还能在一定程度上保护DNA免受制备过程中超声的伤害，并且能有效地防止DNA被体内核酸酶降解，更能加强DNA在酸性条件下的稳定性，并使得以其为内核的PPDs在不同pH条件下带不同电荷。这都为基因传递提供了很好的前提。当pDNA与PLL以静电吸引力作用形成核，再包裹在以生物可降解的mPEG-PLGA-mPEG为壳的纳米粒中，就构成一种核壳结构的新型载基因系统-PPD(PELGE-PLL-DNA)。这种以PELGE为外壳的载基因系统也具有了更好的生物相容性好，更低的细胞毒性，在血浆中也有了更强的稳定性。 我们运用体外细胞培养技术，成功地利用β-半乳糖苷酶和荧光素酶(luciferase)两种报告基因，考察了PPDs介导外源基因的体外细胞转染能力。以β-半乳糖苷酶为报告基因的转染定性地表明了，我们设计制备的PPDs都能成功的转染HepG2和Hela细胞，其在显微镜下计数测得的转染率分别大约为3±0.9％和1.2±0.5％，而不含PLL的PELGE纳米粒和裸DNA转染的细胞中没有观察到转染成功的蛋白表达。 以荧光素酶为报告基因的转染定量地表明了，PPDs转染的HepG 2和Hela细胞其表达出的荧光素酶具有较强的活性，明显高于裸DNA和不含PLL的PELGE纳米粒(p<0.05)，有了数量级的提高，进一步证明了PPDs联合应用多聚阳离子肽和生物可降解的大分子复合物的优越性。随后，我们用MTT法考察了空白纳米粒的细胞毒性。为了检测我们构建的质粒能否准确表达目的基因，我们用pEGFP-C1-IL-18 PPDs转染了肿瘤细胞，考察了其在肿瘤细胞中的表达情况。我们以外观、色泽以及再分散性为指标，筛选了PPDs的冻干粉针剂处方，制备出的PPDs冻干粉针剂达到了设计要求。初步稳定性试验结果表明，PPDs冻干粉针剂在-20℃冰箱中储存放置1周之后，其粒径、zeta电位、包封率以及对核酸的保护能力与冻干前相比均无明显变化。 我们建立了小鼠肺转移肿瘤模型，通过尾静脉给药，评价了PPDs冻干粉针剂携带治疗基因mIL-18在体内的抗肿瘤效果，并通过与化疗药物顺铂(DPP)联用，进一步评价了基因药物与化疗药物的联合治疗效果。试验结果表明，荷瘤小鼠经mIL-18-PPDs冻干粉针剂治疗后，生存期显著长于PBS组、空白纳米粒组和阳性对照组；mIL-18-PPDs冻干粉针剂与DPP联合治疗组小鼠的生存期均又显著长于mIL-18-PPDs冻干粉针剂单独治疗组，说明联合治疗取得了成功。病理学及肿瘤组织的检测结果表明，在PBS组、空白纳米粒组和裸DNA组小鼠的肺脏中，肿瘤转移灶数量多、面积大，说明肿瘤的转移较为严重，并且新生灶的生长较快；而在mIL-18-PPDs组、DPP组以及联合治疗组小鼠的肺脏中，转移灶数量少、面积小，说明小鼠经治疗后，肿瘤的生长得到了明显的控制；其中联合治疗组几乎没有观察到明显的转移灶，组织形态与正常小鼠未见明显区别，说明联合用药达到了很强的抑瘤作用。 此后，鉴于新型构建的PPDs载体对传统纳米粒的转染效果提高明显，我们在PPDs系统中引入叶酸来赋予其靶向性。我们将生物可降解材料换为PELGE的类似物PELGA，由PEG和PLGA聚合形成，再通过酯键与叶酸连接，然后按照同样的复乳．溶剂挥发法制成多聚复合物基因给药系统。利用细胞荧光吞噬试验以及报告基因的表达考察了系统的靶向性。结果表明叶酸修饰过的PPDs在Hela细胞中的摄取明显提高，报告基因的转染更是有了显著性的差异，这都表明叶酸的连接，增加了载体系统的靶向性。 综上所述，我们联合应用了多聚阳离子肽和生物可降解的大分子复合物，可望将其作为一种平台技术，用于制备非病毒基因传递系统。本课题制备的新型纳米多聚复合物基因传递系统能有效介导目的基因的体内外转染，为设计构建种新型、有效的载体系统提供了新的思路。

目录

声明

前言

实验与结果

第一部分质粒DNA的制备及PELGE细胞毒性的评价

第一节表达载体质粒的制备

第二节传递载体细胞毒性的评价

参考文献

第二部分纳米多聚复合物载体系统的制备及其理化性质研究

1仪器和试剂

2实验方法与结果

3小结和讨论

参考文献

第三部分载基因纳米多聚复合物体外细胞学实验研究

1仪器与试剂

2实验方法

3结果

4.小结与讨论

参考文献

第四部分载基因多聚复合物纳米粒冻干粉针剂的研究

1.仪器和试剂

2方法与结果

3小结与讨论

参考文献

第五部分mIL-18-PPDs冻干粉针剂对肺转移肿瘤小鼠的治疗实验研究

1仪器与试药

2实验方法与结果

3实验结果

4小结和讨论

参考文献

第六部分酸复合物的合成及其靶向性研究

1.仪器与试药

2实验方法

3.结果与讨论

4结论

参考文献

结论

综述：高分子载体系统基因治疗的最新研究进展

1前言

2高分子介导基因传递的一般过程

3高分子基因传递载体系统

4克服生理屏障，增加转染率，提高靶向性的研究

5结论及展望

参考文献

致谢

作者简介