hPin1原核表达纯化、热稳定性及与Al相互作用研究

摘要

hPinl是一种肽基脯氨酰顺反异构酶，能特异催化蛋白质分子中pSer/Thr-Pro肽键的顺反构型转变，与多种人类疾病相关，尤其是癌症和阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)。利用Ecoli BL21原核表达纯化得到了His-hPinl融合蛋白，用重组肠激酶酶切除去组氨酸标签得到hPinl。首次借助SDS-PAGE、紫外差吸收光谱、内源荧光光谱、圆二色谱法和PPIase酶活测定等方法研究了hPinl的热稳定性，以及Al<'3+>与hPinl的相互作用．。 在中性条件下不同温度处理后，SDS-PAGE分析表明，低于50℃处理不会影响His-hPinl或hPinl的溶解性，60℃～100℃处理会使其部分变性而沉淀。内源荧光发射光谱研究表明，未热处理的His-hPinl和hPinl都具有约340nm的荧光发射峰；热处理使荧光发射峰的位置发生一定改变，低于40℃处理对hPinl的荧光强度影响较小，50℃～100℃热处理使hPinl的荧光强度明显降低。圆二色谱研究表明，热处理对hPinl的二级结构有显著影响，引起α-螺旋含量的明显减少，而无规卷曲增加。低于40℃热处理不会影响hPinl的异构酶活性，而50℃以上热处理导致hPinl的异构酶活性降低。以上结果表明hPinl是一个相对热稳定的蛋白。 紫外差时间扫描光谱检测到Al<'3+>-hPinl体系的LMCT带，吸光值随时间增加而增加。内源荧光光谱可知，随着Al<'3+>的加入，hPinl的内源荧光发生淬灭，双分子淬灭常数K<,q>为9.14×10<'11>(mol/L)<'-1>·S<'-1>，内源荧光的最大发射波长λ<,em,max>发生红移，说明色氨酸残基逐渐暴露于溶剂当中，hPinl分子构象发生一定改变。圆二色谱研究表明Al<'3+>的结合使hPinl的二级结构发生一定改变，表现为α-螺旋减少，β-折叠和无规卷曲增加。另外，Al<'3+>使hPinl的异构酶活性降低。以上结果表明，由于Al<'3+>的结合，影响了hPinl的结构，导致其PPIase活性降低。由Al<'3+>引起hPinl的活性降低也许是AD病发的一个潜在因素。

目录

声明

摘要

前言

1材料、试剂、仪器

1.1材料

1.2试剂

1.2.1主要试剂来源

1.2.2常用培养基

1.2.3常用溶液

1.3仪器

2方法

2.1 His-hPin1原核表达纯化

2.1.1感受态细胞制备

2.1.2 pET-19b-hPin1转化大肠杆菌

2.1.3 His-hPin1的表达和纯化

2.1.4 His-hPin1的酶切

2.2 hPin1的热稳定性

2.2.1 SDS-PAGE实验

2.2.2荧光光谱测定

2.2.3圆二色谱测定

2.2.4酶活测定

2.3 Al3+对hPin1相互作用研究

2.3.1 SDS-PAGE实验

2.3.2紫外差光谱的测定

2.3.3荧光光谱测定

2.3.4圆二色谱测定

2.3.5酶活测定

3实验结果

3.1原核表达纯化

3.1.1重组质粒pET-19b-hPin1的酶切鉴定和转化

3.1.2 His-hPin1的表达和纯化

3.1.3 His-hPin1的酶切

3.2热稳定性

3.2.1热处理对溶解性的影响

3.2.2热处理对荧光光谱的影响

3.2.3热处理对圆二色谱的影响

3.2.4热处理对hPin1的PPIase活性的影响

3.3 Al3+对hPin1结构和功能影响的研究

3.3.1 Al3+对hPin1溶解性的影响

3.3.2 Al3+与hPin1相互作用的LMCT带检测

3.3.3 Al3+对hPin1荧光发射光谱的影响

3.3.4 Al3+对hPin1圆二色谱的影响

3.3.5 Al3+对hPin1的PPIase活性的影响

4结论

4.1 hPin1的热稳定性质

4.2 Al3+与hPin1的相互作用

4.2.1 Al3+对hPin1性质和功能的影响

4.2.2 hPin1与Al3+可能的结合机制

4.2.3 Al3+和hPin1在AD病发中的作用

4.3影响hPin1表达和纯化的因素

参考文献

综述 肽基脯氨酰顺反异构酶Pinl研究进展

致谢

附录