嗅鞘细胞移植修复大鼠脊髓半横断损伤的实验研究

摘要

目的：探索一种简便、经济实用的获得大鼠嗅鞘细胞(olfactoryensheathing cells，OECs)的方法；观察OECs对脊髓半横断损伤(hemisection of spinal cord injury,，hSCI)大鼠的后肢运动功能、后肢小腿三头肌横截面积和直径的影响；检测Sema3A、NP-1、Vcxsican在脊髓腹角中的表达，初步探讨OECs修复损伤脊髓的机制。 方法： 取2.5月龄雌性SD大鼠嗅球最外二层，经胰蛋白酶消化和机械吹打分散成单细胞悬液，以1×10<'6>/mL 密度种植于含20％胎牛血清的DMEM/F12培养液中，在培养的第12h和24h分别进行两次差速贴壁处理，第7d加入5×10<'-5>mol/L的阿糖胞苷作用36h左右以除去成纤维细胞，定期进行形态学观察并摄片。第14d用ABC法进行胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和神经生长因子受体(nerve growth factor receptor p75，NGFRp75)的免疫细胞化学染色鉴定，并计算OECs的纯度；分别收集培养上清液和细胞(密度为1×10<'7>/mL)备用。 35只雌性成年SD大鼠，5只不做任何处理为正常组，另外30只随机分成A、B、C、D、E组，制成脊髓左侧半横断损伤模型后随即分别移植纯化的OECs悬液、纯化的OECs培养上清液、未纯化的OECs悬液、未纯化的OECs培养上清液、DMEM/F12培养液，术后第1d、3d、5d、1w、2w、3w、4w、5w、6w分别进行BBB评分和IP试验。 术后第6w，4％多聚甲醛灌注固定所有大鼠，取左侧后肢小腿三头肌及T<,11>～T<,12>脊髓节段。 肌组织经常规石蜡包埋、切片(片厚5μm)、HE染色，采用Image-pro plus5.0.2图象分析软件测量各组肌细胞横截面积和直径。 脊髓标本冰冻横切片，片厚30gm，用ABC法分别进行Sema3A(1:1600)、NP-1(1:400)和Versican(1:1200)免疫组化染色，同时设立空白对照组及置换实验组；光镜下观察并计数腹角免疫组化反应阳性神经元数，采用同上软件测量各组脊髓腹角Sema3A、NP-1及Versican免疫组化反应阳性反应物的平均光密度值(正常组取任意侧，各手术组均取左侧)。 结果用单因素方差分析及SNK法进行统计学分析，凡P<0.05，结果有统计学意义。 结果： 培养的OECs呈双极、多极、扁圆形三种，以双极和多极细胞为主。GFAP反应阳性细胞胞质和突起黄染，胞核无染呈空泡状；NGFRp75染色为胞质和突起淡染，胞核深染。GFAP免疫细胞化学染色阳性细胞率为91％，NGFRp75免疫细胞化学染色阳性细胞率为90％，表明获得了高纯度的OECs。 各组BBB评分在术后第1d均为0，后渐增高，第2w时可达到6分左右。3w后A组评分明显较其它手术组高，差异有统计学意义(P<0.05)；各组的IP试验在术后第1d从术前的85°降至12.5°左右，随着时间的推移逐渐升高。4w后A组明显较其它手术组高，差异有统计学意义(P<0.05)，表明纯化的OECs移植组大鼠后肢运动功能的恢复最好。各手术移植组在术后第6w左侧后肢小腿三头肌纤维横截面积及直径均较正常组减少，E组减少最多，A组减少幅度明显较其它手术组小，差异有统计学意义(P<0.05)，表明纯化的OECs移植组大鼠后肢小腿三头肌萎缩程度最轻。 Sema3A、NP-1、Versican在各组脊髓腹角运动神经元均有表达，免疫组化反应阳性产物定位于胞浆，各手术组免疫组化反应阳性神经元数及平均光密度值均较正常组增加，E组最高，A组增幅明显较其它手术组低，差异有统计学意义(P<0.05)，表明纯化的OECs移植组在该三者的表达下调较其它手术组明显。 结论： 1．差速贴壁和阿糖胞苷化学抑制相结合进行成年大鼠OECs原代培养是一种简便、经济实用的方法，可获得高纯度的OECs。 2．OECs移植能明显促进hSCI大鼠后肢运动功能恢复。 3．OECs移植能减轻hSCI大鼠后肢小腿三头肌萎缩。 4．OECs移植促进hSCI再生修复、功能改善的原因可能与降低Sema3A、NP-1和Versican的表达有关。

目录

声明

前 言

材料和方法

1实验仪器及试剂

2实验方法

结 果

1 OECs原代培养及鉴定

2 术后动物一般情况

3 行为学评分结果

4 各组左侧后肢小腿三头肌肌细胞横截面积及直径变化

5 Sema3A在脊髓腹角的表达变化

6 NP-1在脊髓腹角的表达变化

7 Versican在脊髓腹角的表达变化

讨 论

1 OECs的培养、纯化及鉴定

2 SCI模型的选择

3 行为学评分方法的选择及各组评分差异的可能原因

4 各组左侧后肢小腿三头肌形态学变化

5 Sema3A、NP-1、Versican在各组的表达及意义

结 论

参考文献

论文图片及说明

综述 嗅鞘细胞与脊髓损伤再生修复

在读期间科研成果简介

致 谢