高速逆流色谱大规模纯化和厚朴酚及应用SILAC技术研究和厚朴酚治疗HepG2细胞作用机理

摘要

和厚朴酚是中药厚朴的主要化学成分。据报道：和厚朴酚具有多途径抗肿瘤机制，如诱导细胞增殖与分化，引起细胞凋亡，其机制与上调促凋亡因子Bid、下调抑凋亡因子Bcl-XL，以及激活p53非依赖、线粒体依赖的Caspase通路有关。由于动物实验需要，我们需要找到一种高效快速的分离技术纯化出大量的和厚朴酚，高速逆流色谱仪是一种液液分离装置，经过多年的改进，发展为一种快速的分离技术，可以和高效液相色谱媲美，是一种分离天然药物的理想的设备。SILAC技术：即是用同位素标记必需氨基酸，将它加到缺乏此氨基酸的培养基，用此培养基培养细胞，经过细胞代谢，标记的氨基酸融合到蛋白中，形成内码子。它与质谱结合，为定量蛋白组提供了和好的技术。本文旨在用高速逆流色谱从植物厚朴中大规模分离和厚朴酚，并利用SILAC技术，将和厚朴酚治疗同位素标记的肝癌细胞HepG2，通过质谱鉴定，用定量蛋白组的方法鉴定出和厚朴酚引起的蛋白调控，从而确定出和厚朴酚抗肿瘤的作用机理。 方法：使用英国布鲁内尔提供的分析型HSCCC优化分离的条件，包括流速、进样浓度、进样量。并将优化的条件放大到制备型HSCCC。大规模分离纯化出和厚朴酚。用和厚朴酚治疗经亮氨酸--d3完全标记的肝癌细胞HepG2，提取蛋白，利用质谱检测总蛋白，以保守蛋白β--actine为标准，确定出和厚朴酚引起调控的蛋白。推断出和厚朴酚抗肿瘤作用机理。 结果：经分析型HSCC优化，逆流色谱分离的条件为：转速为每分钟1800转；流速为每分钟2.5毫升；进样量为分离柱的5％；进样浓度为每毫升80毫克。这些优化的条件成功的运用到制备型高速逆流色谱。在大规模分离纯化和厚朴酚与厚朴酚中，我们用三种不同的浓度(20mg/ml，75mg/ml，250mg/ml)进样，从59.2克粗品中分离出纯度高达99.9％的厚朴酚24.7克与纯度高达98.6％的和厚朴酚23.2克。我们用10 μ g/ml浓度和厚朴酚作用HepG2细胞24h。通过质谱鉴定了290个蛋白，其中和厚朴酚引起蛋白上调占了5.5％，下调蛋白占了72.4％；与细胞凋亡相关的蛋白有23个。 结论：本文中，我们成功利用了HSCCC大规模纯化和厚朴酚。采用SILAC技术，我们发现了和厚朴酚引起的蛋白调控，其中在与细胞凋亡相关的蛋白中，我们选择 Ras GTPase-activating-like protein IQGAPl(p195)与 94kDaglucose-regulated protein(GRP94)进行PCR与Westen-blot验证。证实了和厚朴酚可能通过引起一系列的蛋白调控来诱导细胞的凋亡。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 应用高速逆流色谱大规模化和厚朴酚与厚朴酚

1.1前言

1.2实验部分

1.2.1实验试剂与实验样品

1.2.2实验仪器

1.2.3样品制备

1.2.4选择两相溶剂系统

1.2.5两相体系的配制与样品的溶解

1.2.6 MINI-DE CCC分离程序

1.2.7采用MINI-DE CCC优化分离条件

1.2.8 MAXI-DE CCC分离程序

1.2.9高效液相色谱分析MINI-DE CCC馏分

1.3结果和讨论

1.3.1 MINI-DE CCC分离和厚朴酚与厚朴酚

1.3.2 MAXI-DE CCC分离厚朴酚与和厚朴酚

1.4结论

参考文献

第二章 定量蛋白组学：应用SILAC(稳定同位素标记法)研究和厚朴酚治疗肝癌细胞HepG2

2.1.前言

2.2.实验材料

2.2.1细胞株

2.2.2试剂和材料

2.2.3实验仪器和设备

2.3实验方法：

2.3.1实验流程图：

2.3.2试剂配置

2.3.3细胞培养

2.3.4 MTT

2.3.5流式细胞检测细胞凋亡及周期

2.3.6细胞裂解与样品制备

2.3.7 SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制

2.3.8加样与电泳

2.3.9 1D SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳)

2.3.10凝胶考马斯亮蓝染色

2.3.11质谱鉴定和生物信息学分析

2.3.12 RT-PCR

2.3.13 Westen blot

2.4结果

2.4.1和厚朴酚对HepG2细胞增殖的影响

2.4.2和厚朴酚对HepG2细胞周期的影响

2.4.3用稳定同位素标记HepG2细胞

2.4.4定量蛋白

2.4.5总蛋白鉴定

2.4.6被和厚朴酚调控蛋白的鉴定

2.4.7生物信息学分析

2.4.8 PCR验证

2.4.9 Westen-blot

2.5 讨论

参考文献

第三章 综述：高速逆流色谱的研究进展及和厚朴酚抗肿瘤作用机理

3.1高速逆流色谱

3.1.1高速逆流色谱分离原理

3.1.2溶剂系统的选择

3.1.3高速逆流色谱的应用

3.1.4高速逆流色谱的新进展

3.1.5总结

3.2.厚朴

3.2.1厚朴的形态特征

3.2.2厚朴的化学成分

3.2.3厚朴的药理作用

3.3和厚朴酚

3.3.1和厚朴酚的理化性质

3.3.2和厚朴酚的抗肿瘤作用

3.3.3总结

参考文献

作者及指导教师简介

致谢