乙型肝炎病毒表面抗原蛋白反式调节作用的研究

摘要

乙型肝炎病毒(HBV)感染是严重影响我国人民健康的重要传染病。尽管抗病毒治疗在一部分患者中取得了一定的疗效，但总的疗效不满意。因此，必须探索新的治疗技术和方法，要探索新的治疗技术和方法，就要以肝炎病毒致病的机制作为基础。我们应用分子生物学技术对于肝炎病毒与肝细胞之间相互作用的分子生物学机制进行系统的探讨，目的是为病毒性肝炎新型治疗技术和方法的研究寻找新的思路、奠定理论基础。 HBV是一种嗜肝部分双链DNA病毒，其基因组长约3.2kb，具有4个主要的开放读码框架(ORF)，分别命名为S、C、P、X区，其中S区通过三个框架(in-frame)内起始密码子(ATG)分为三个结构域：前-S1，前-S2和S结构域，从这三个ATG开始编码产生三种大小不等的表面抗原蛋白：主蛋白(SHBs)，中蛋白(MHBs：前-S2+S)和大蛋白(LHBs：前-S1+前-S2+S)。HBV表面抗原蛋白具有多种功能，其中反式调节功能在HBV致病(癌)过程中发挥着重要的作用。 为研究HBV表面抗原蛋白的反式调节作用，我们以分子生物学技术构建表面抗原蛋白的真核表达载体pcDNA3.1(-)-SHBs、pcDNA3.1(-)-PreS1、pcDNA3.1(-)-PreS2，并将构建好的重组质粒转染HepG2细胞，以空载体为平行对照，制备细胞裂解液。应用抑制性消减杂交(suppressionsubtractivehybridization，SSH)技术，构建表面抗原蛋白激活基因差异表达的cDNA消减文库，转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆，多聚酶链反应(PCR)扩增后进行测序及同源性分析。对转染后的细胞裂解液同时应用基因表达谱芯片技术筛选差异表达的mRNA。筛选到的cDNA全长序列，包括一些与细胞生长调节、细胞内信号转导、蛋白质翻译合成、肿瘤、物质代谢密切相关的蛋白编码基因，推测表面抗原蛋白在体内可能存在的调控机制的线索，并发现一些未知功能的基因，其中之一命名为HBV前-S1蛋白反式激活蛋白1(PS1TP1)。 在新基因功能研究方面，我们对PS1TP1的功能进行了初步探讨。应用生物信息学及常规分子生物学技术从HepG2细胞中得到了PS1TP1基因的编1码区，进行T/A克隆，并定向克隆至原核表达载体pET32a(+)中，转染大肠杆菌，使用IPTG诱导，制备细菌裂解液并行聚丙烯酰胺凝胺电泳(PAGE)，之后行蛋白印迹杂交(Westernblotting)，鉴定正确后得到了能够表达PS1TP1的菌株。进一步应用噬菌体展示筛选PS1TP1启动子DNA序列的结合蛋白，以明确其上游的调节机制。应用生物信息学方法确定PS1TP1基因启动子序列，以PCR技术扩增PS1TP1启动子DNA片段，常规分子生物学方法构建真核报告载体pCAT3-PS1TP1p，以该质粒转染HepG2细胞系，用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)表达活性以明确所得到的DNA片段具有启动子活性；以PS1TP1启动子DNA片段作为固相筛选分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集过程，噬斑裂解液PCR扩增后，进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索。结果提示噬菌体经富集后，筛选出18个阳性克隆，分析了这些蛋白的功能。对该基因的功能进行的初步了解，为下一步更加具体的生物学功能、基因表达调控的深入研究开辟道路。

目录

前言

第一部分 应用抑制性消减杂交筛选表面抗原蛋白反式激活基因

第一节实验方法

第二节实验结果

第三节讨论

第二部分 应用基因芯片筛选表面抗原蛋白基因转染细胞差异表达基因

第一节实验方法

第二节实验结果

第三节讨论

第三部分 差异表达分析结果的验证

第一节实验方法

第二节实验结果

第三节讨论

第四部分 PS1TP1新基因功能的初步研究

第一节PS1TP1基因的克隆化

第二节PS1TP1基因启动子的构建

第三节噬菌体展示技术筛选PS1TP1启动子DNA结合蛋白

第四节PS1TP1的原核表达

第五节讨论

参考文献

综述 乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒对MAPKKK蛋白信号转导的影响

附录一主要仪器设备

附录二英文缩略词

攻读硕士学位期间发表的文章

致谢