野生大麦Hsp17基因的克隆与序列多样性分析

摘要

野生大麦是一年生的二倍体（2n=2x=14）严格自花授粉的禾本科植物，染色体数目为x=7，自交率达98％，它是现代栽培大麦的祖先，可以独自生存和繁衍而不依赖人类农事活动，在中东的以色列地区、土耳其、阿富汗等地有着广泛的分布，并且有着丰富的遗传多样性[1]。野生大麦相对其他作物而言，相对比较保守，同时，它的生育期短、早熟、抗逆性强、丰产、适应性广，并且在野生和栽培大麦的形式上没有杂交的障碍，自然和人工杂交都很容易得到。正是由于野生大麦这些特殊的性质，所以它成为了研究植物适应性进化的重要模型植物，被认为是21世纪遗传改良的重要基因资源。
　　干旱导致生物体内蛋白质的合成和mRNA的转录受到抑制，同时迅速诱导合成一类进化上非常保守的蛋白质，即热激蛋白（heat shock protein，Hsps），这种反应会允许生物体忍耐水分胁迫的逆境。α-晶体蛋白区域是低分子量Hsps的标志[64]，它以分子伴侣的方式在生物体受到热胁迫时防止蛋白质的聚集和变性蛋白的重折叠，而亮氨酸的疏水性则在α-晶体蛋白区域中具有很重要的作用。目前，Hsps在动物中研究居多，而植物中研究相对较少。已经从水稻、小麦中分离鉴定出了部分Hsps，但在野生大麦中未见报道，所以本研究以野生大麦小分子量热激蛋白Hsp17作为研究对象，对17个来自世界各地的具有代表性的野生大麦居群材料进行了Hsp17基因克隆与序列分析，主要结果如下：
　　1、克隆得到17种野生大麦材料的19个Hsp17片段序列，经测序获得两种不同大小的序列，长序列为1341～1355bp，短序列为939～1004bp。从基因结构上看，Hsp17基因的长、短片段在启动子区和编码区长度也无明显差异，长片段与短片段的明显差异在于短片段在3UTR上比长片段少了一部分序列。
　　2、氨基酸序列分析表明，由17种野生大麦的Hsp17基因推导的氨基酸序列虽然存在不同，但是从二级结构上看，碳末端所包含的α-晶体蛋白中编码亮氨酸的位点有很强的保守性。
　　3、系统发生树分析发现，野生大麦基因组中Hsp17蛋白基因发生了多次进化。而Hsp17基因序列并没有从地理结构上得到明显的区分，所有扩增出的短序列的材料几乎都是由扩增出长序列的材料进化而来，而所有的片段（除PI268242），都是以栽培大麦冬青八号的长序列（LD17）和野生大麦PI254894（6S Iraq）为祖先进化而来。材料PI268242和PI220523与其他材料的序列有明显的差异，PI268242进化关系最远，基因型最古老，属于祖先材料，而PI220523进化关系最近，由祖先材料经过若干代进化而来。
　　4、从本次实验的叶片失水率统计看，材料PI268242的失水率最大，PI220523的失水率最小，说明材料PI220523更具有抗旱性，而材料PI268242比较不利于抗旱。
　　综上，本研究克隆并系统分析了19个应对干旱胁迫反应的Hsp17蛋白基因序列多样性及其与抗旱性的关系，明确了大麦族物种的演化与Hsp17蛋白基因家族进化的内在联系，提供了基因结构与功能变异与环境适应性进化的新证据，揭示了Hsp17蛋白基因家族快速进化的特征，获得了可用于大麦分子染色体工程育种的新基因和新标记，具有重要理论和应用价值。

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第一章 绪论

1.1野生大麦遗传多样性研究

1.2大麦抗旱性相关研究

1.3植物热激蛋白（Hsps）的研究

1.4选题依据

第二章 实验方法与步骤

2.1实验材料

2.2 Hsp17的克隆及序列分析

2.3叶片失水率的测定

第三章 结果与分析

3.1 PCR产物电泳结果

3.2野生大麦Hsp17基因序列分析

3.3氨基酸序列及疏水性分析

3.4系统进化分析

3.5失水率统计

第四章 讨论

4.1野生大麦对干旱胁迫的反应

4.2大麦胁迫反应基因研究

4.3野生大麦资源与抗旱育种

第五章 结论

致谢

参考文献

攻硕期间取得的研究成果