干旱胁迫下西藏野生大麦根毛生长调控基因HvEXPB7的分离、克隆和功能鉴定

摘要

干旱是限制作物产量的一个重要因素。培育耐旱作物品种提高作物的耐/抗旱能力是作物生产亟需解决的关键问题之一;而发掘耐旱种质，明确其耐性机制是培育耐旱作物品种和制订耐旱栽培措施的基础。根毛是吸收养分和水分的重要器官，对植物耐旱性起着重要作用。根毛发育和生理功能受遗传制约，也受土壤湿度等环境条件的影响，迄今已鉴定到若干与拟南芥属植物根表皮细胞特化、根毛细胞分化、根毛初始伸长和顶端生长等相关的基因。但有关单子叶植物根毛响应干旱胁迫时的遗传基础和分子调控机制仍未见报道。青藏高原一年生野生大麦（Hordeum vulgare L.ssp.spontaneum）具有丰富的遗传多样性，能为作物品种改良，培育抗逆性（如耐/抗干旱）作物新品种提供优异的候选基因。本研究以课题组已筛选到的耐旱野生大麦XZ5为材料，在分析研究干旱胁迫对不同耐性基因型大麦根毛生长与转录组的影响及基因型差异的基础上，分离克隆干旱胁迫下野生大麦根毛生长调控基因HvEXPB7，研究西藏野生大麦耐旱的分子机理。主要研究结果如下:
　　1.以高耐干旱的青藏高原一年生野生大麦XZ5为材料，以干旱敏感野生大麦XZ54和国际公认耐旱大麦品种Tadmor为对照，水培PEG（聚乙二醇，Polyethylene glycol）模拟干旱胁迫试验，观察干旱胁迫对根毛生长的影响及基因型差异，发现PEG模拟干旱1d根毛大量脱落，干旱条件下基因型间根毛生长无显著差异;干旱处理第3和5d大麦幼苗重新长出根毛，其中抗旱野生大麦XZ5根毛发生量显著多于敏感种质XZ54及抗旱品种Tadmor;随着干旱处理时间的延长，只有XZ5具有发达的根毛表型特征。
　　2.液氮中分离足量三个大麦基因型根毛，利用转录组测序的方法，比较分析大麦根毛基因表达响应干旱胁迫的基因型差异。结果表明，干旱胁迫诱导XZ5根毛中更多的基因表达发生变化。PEG模拟干旱条件下，XZ5、XZ54和Tadmor根毛中差异表达基因，分别有216、19和77个;鉴定到与XZ5耐旱相关的差异表达基因36个，其表达表现为干旱胁迫条件下XZ5上调表达且XZ54下调/不变，或XZ5表达不变且XZ54下调表达（干旱vs对照）;功能预测结果显示，这些基因主要参与能量代谢、抗氧化胁迫、抗逆胁迫、细胞壁修饰和根毛生长等生物学过程。将这些基因在两个耐旱基因型XZ5和Tadmor中进行比较分析发现，其中16个基因，其响应干旱胁迫时的表达在两基因型间不一致;其中β-expansin基因在XZ5中干旱诱导显著上调，而在Tadmor中不受干旱诱导。
　　3.采用RACE方法从XZ5中克隆了该β-expansin基因的全长，序列比对表明该基因含有expansin家族基因典型的两个功能域DPBB1和Pollon_allerg_1以及一些高度保守的结构域。进化树分析结果显示该基因属于EXPB家族成员，并且进化上和水稻OsEXPB7较近，因此将该基因命名为HvEXPB7。比较三个大麦基因型HvEXPB7基因CDS区和启动子区序列显示，该基因在野生大麦耐旱基因型XZ5中保留了最高的遗传多态性和最多的根毛调控元件RHEs(Root hair specific cis-elements)，组织特异性表达分析表明HvEXPB7基因主要在XZ5的根中表达，亚细胞定位结果显示HvEXPB7蛋白会进入分泌途径最终定位在细胞质膜上。
　　4.利用BSMV-VIGS(Barley stripe mosaic virus induced gene silencing)方法在XZ5中成功沉默了HvPDS报告基因，首次建立了野生大麦的BSMV-VIGS体系。在干旱和正常生长条件下，BSMV-VIGS诱导HvEXPB7基因沉默植株的根毛长度和数量都显著差于对照植株。同时，HvEXPB7基因沉默植株根系干物质重和根系K+浓度都显著低于对照(正常XZ5);叶面喷施乙烯可以使这种抑制作用得到部分恢复，同时干旱条件下这种恢复效果更明显。Hv EXPB7基因可以调控XZ5中根毛的生长，进而影响干旱条件下根系K+吸收以及植株的生长。研究结果加深了青藏高原一年生野生大麦中特有的耐旱相关基因及其耐旱分子机制的认识，为培育耐旱大麦品种提供了新的基因资源。

目录

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致谢

缩略词表

图表目录

摘要

第一章 文献综述

1．1 植物应答干旱胁迫的主要机制

1．1．1 植物应答干旱胁迫形态结构变化

1．1．2 植物应答干旱胁迫生理机制

1．1．3 植物应答干旱胁迫分子机制

1．2 根毛研究进展

1．2．1 根毛的主要功能

1．2．2 被子植物根毛形成类型

1．2．3 根毛发生调控

1．2．4 根毛形成过程

1．3 Expansin研究进展

1．3．1 Expansin的发现与分类

1．3．2 Expansin的结构

1．3．3 Expansin的功能

1．3．4 Expansin的作用机制

1．4 VIGS概述

1．4．1 VIGS研究进展

1．4．2 VIGS作用机制

1．4．3 BSMV-VIGS研究进展

1．5 本研究的目的意义

第二章 大麦根毛转录组响应干旱胁迫的基因型差异

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 大麦材料

2．2．2 主要试剂

2．2．3 大麦根系扫描和根毛表型观察

2．2．4 大麦根毛分离

2．2．5 根毛RNA提取、文库构建及转录组测序(RNA-seq)

2．2．6 GO注释和功能分类

2．2．7 qRT-PCR验证

2．3 结果与分析

2．3．1 干旱对大麦根系和根毛表型的影响及基因型差异

2．3．2 干旱胁迫对大麦根毛基因表达谱的影响及基因型差异

2．3．3 干旱条件下仅在耐旱基因型XZ5根毛中高表达的基因

2．3．4 qRT-PCR验证RNA-Seq结果

2．4 讨论

第三章 野生大麦HvEXPB7基因的克隆和初步分析

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 大麦材料与生长条件

3．2．2 菌株和主要试剂及载体

3．2．3 HvEXPB7基因全长克隆

3．2．4 HvEXPB7基因功能域比对和进化树分析

3．2．5 HvEXPB7基因组织表达和亚细胞定位

3．2．6 HvEXPB7启动子克隆和基因序列比对

3．3 结果与分析

3．3．1 HvEXPB7基因克隆分析

3．3．2 HvEXPB7基因功能域比对结果

3．3．3 HvEXPB7基因进化树结果分析

3．3．4 HvEXPB7基因组织表达和蛋白亚细胞定位结果

3．3．5 HvEXPB7基因启动子克隆和RHEs分析

3．3．6 三个大麦基因型中HvEXPB7基因CDS区比较

3．4 讨论

第四章 BSMV-VIGS验证HvEXPB7基因功能

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 大麦材料与生长条件

4．2．2 菌株和主要试剂及载体

4．2．3 BSMV：HvPDS和BSMV：HvEXPB7载体构建

4．2．4 BSMV载体线性化和体外转录

4．2．5 野生大麦BSMV-VIGS体系建立

4．2．6 BSMV接种验证基因功能

4．2．7 RT-PCR分析HvPDS和HvEXPB7基因的表达量

4．2．8 乙烯含量测定

4．2．9 K+含量测定

4．2．10 数据分析

4．3 结果与分析

4．3．1 BSMV：HvPDS和BSMV：HvEXPB7重组载体鉴定

4．3．2 野生大麦XZ5 BSMV-VIGS体系建立

4．3．3 利用BSMV-VIGS方法在野生大麦XZ5上验证HvEXPB7基因功能

4．4 讨论

第五章 全文总结与展望

参考文献

附录

作者简介