应用RNAi和反义核酸技术治疗β地中海贫血的基础研究

摘要

至今世界上已发现200多种β地贫突变型，其中β珠蛋白基因第2内含子第654位C→T的剪接缺陷型突变(IVS-2-654C→T,β654)是导致中国人β地贫特有的、也是最常见的突变型之一。Β地贫的主要特征是成人型血红蛋白(HbA，α2β2)中β珠蛋白肽链的合成减少或缺乏，主要发病环节为红细胞内α和β珠蛋白肽链合成速率的不平衡。本课题拟在原来应用反义RNA治疗β654贫血研究的基础上，首次设计和构建特异性针对α或β珠蛋白基因的RNAi干扰载体，开展RNAi和反义核酸技术介导基因治疗β654地贫的基础研究，目的是降低过剩α珠蛋白沉积、纠正异常剪接的β珠蛋白肽链、平衡α链/β链比例，为β地中海贫血的基因治疗提供理论依据和应用基础。　　首先，我们应用RNAi技术抑制报道基因绿色荧光蛋白(eGFP)在细胞水平和转基因小鼠个体水平的特异性表达，证明了应用RNAi技术在个体水平进行基因治疗的可行性。其次，在细胞水平我们应用RNAi技术抑制α珠蛋白的表达，为抑制α珠蛋白沉积、平衡α/β珠蛋白合成比例奠定基础；第三，通过抑制异常剪接β珠蛋白mRNA的表达，以及应用特异性表达的反义核酸载体纠正异常剪接的β珠蛋白mRNA，为消除异常剪接的β珠蛋白肽链的危害提供依据。最后，在个体水平应用质粒载体改善β654模型小鼠的贫血症状。

目录

论文说明：缩略词

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引言

参考文献

第一部分RNAi抑制红系特异表达的eGFP

Part Ⅰ载体的构建

Part Ⅱ siRNA抑制293T、Mel细胞eGFP表达的研究

Part Ⅲ siRNA抑制转基因小鼠体内红系特异表达的eGFP

讨论

参考文献

附图

第二部分RNAi抑制α珠蛋白的表达

Part Ⅰ特异性针对α珠蛋白mRNA的siRNA载体构建

Part Ⅱ siRNA抑制小鼠Mel细胞α珠蛋白mRNA的表达

Part Ⅲ siRNA抑制人K562细胞α珠蛋白的表达

讨论

参考文献

附图

第三部分RNAi和反义核酸技术对异常剪接β珠蛋白的作用

Part Ⅰ异常剪接β珠蛋白基因、反义核酸和siRNA载体的构建

Part Ⅱ反义核酸、siRNA对异常剪接β珠蛋白mRNA的抑制作用

讨论

参考文献

附图

第四部分RNAi和反义核酸技术对β654地贫模型小鼠贫血的改善作用

Part Ⅰ RNAi和反义核酸质粒载体对β654地贫模型小鼠贫血的改善作用

PartⅡ反义核酸病毒载体的构建

Part Ⅲ反义核酸病毒载体改善β654模型小鼠的贫血症状

讨论

参考文献

附图

小结

综述一慢病毒载体与造血干细胸介导的基因治疗

综述二依赖于DNA的RNA polymerase Ⅲ与基因表达和基因治疗

已发表文章和申请专利

致谢