乙型肝炎病毒DNA聚合酶功能域结合蛋白和反式调节基因的研究

摘要

乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒，HBVDNA长度约为3.2kb，含4个开放读码框架(ORF)，分别编码HBV的表面抗原蛋白，核心/e抗原蛋白，X蛋白以及HBVDNA聚合酶(HBVPo1)。HBVPol基因在ORF中最长，并且与C、S、X基因区有重叠，其编码的P蛋白含有3个功能域和1个无意义的隔离片(spacer，SP)，排列顺序为N-末端蛋白(TP)，SP，逆转录酶(RT)/DNA聚合酶(PR)和核糖核酸酶H(RNaseH)。由于受到不能从病毒体直接纯化和在不同的系统中表达有活性的酶的限制，目前对聚合酶及其所编码的各个功能区域蛋白质的功能的认识还不是很清楚。为了研究病毒蛋白质对肝细胞的作用，用酵母双杂交技术筛选HBVPol蛋白与肝细胞相互作用蛋白的编码基因；用基因表达谱芯片技术，筛选各功能域的反式调节基因。 根据含有HBVPol全基因组cDNA的质粒G318A7AF384372，设计了TP、PR和RNaseH引物，PCR扩增后构建酵母表达载体pGBKT7-TP、pGBKT7-PR、pGBKT7-RNaseH，用醋酸锂法转入酵母细胞AH109后，表达各自蛋白，用Westernblotting确定蛋白表达。将转化好的AH109/pGBKT7-TP酵母菌与含有肝cDNA文库的酵母菌Y187在营养缺陷培养基(三缺培养基：SD/-His/-Leu/-Trp，四缺培养基：SD/-Trp-Leu-His-Ade)上进行配合，在铺有X-α-gal的四缺培养基上进一步筛选。挑取蓝色阳性菌落提取酵母质粒。测序并进行生物信息学分析。 对TP的研究中，成功得到47个与TP特异性结合的阳性克隆，包括人类固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)、Ⅰ型乙醇脱氢酶γ亚基(ADH3)，也称为依赖谷胱甘肽的甲醛脱氢酶，RNA聚合酶Ⅱ亚单位(hsRPB7)、血浆铜蓝蛋白(CP)，去唾液酸糖蛋白受体2(ASGR2)等21种已知功能蛋白质基因和19个假设蛋白基因。提示TP可以与人肝细胞内某些已知和未知功能蛋白相互结合，具有较广泛的生物学功能。 利用基因表达谱芯片技术研究HBVPol三个功能域TP、PR和RNaseH对肝细胞基因表达谱的影响：设计引物并构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-TP，pcDNA3.1(-)-PR和pcDNA3.1(-)-RNaseH，以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取mRNA，逆转录为cDNA，与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析。结果TP有¨1条基因表达水平上调，88个基因表达水平下调。PR有79条基因表达水平上调，90条基因表达水平下调。RNaseH有113条基因表达水平上调，109条基因表达水平下调。提示它们对HepG2细胞中许多不同基因表达的调节作用，证明这些基因与细胞信号转导、细胞增殖与分化、细胞凋亡等生物过程密切相关，对我们进一步深入研究HBVPol在慢性HBV感染中的作用具有重要意义。

目录

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前言

第一部分基因表达谱芯片技术筛选HBV DNA聚合酶三个功能域的反式调节基因

引言

第一章HBV DNA聚合酶TP反式调节基因的筛选研究

第二章HBV DNA聚合酶PR反式调节基因的筛选研究

第三章HBV DNA聚合酶RNase H反式调节基因的筛选研究

讨论

参考文献

第二部分HBV DNA聚合酶功能域蛋白酵母双杂交“饵”载体的构建与表达

引言

第一章HBV DNA聚合酶TP蛋白酵母双杂交“饵”载体构建与酵母中表达

第二章HBV DNA聚合酶PR蛋白酵母双杂交“饵”载体构建与酵母中表达

第三章HBV DNA聚合酶酶RNase H蛋白酵母双杂交“饵”载体构建与酵母中表达

讨论

参考文献

第三部分酵母双杂交筛选与TP蛋白相互作用蛋白

引言

第一节酵母配合筛选

第二节从阳性酵母中提取质粒

第三节复杂方法冰冻高效价感受态方案

讨论

参考文献

总结及展望

攻读博士学位期间发表的文章

文献综述一 乙型肝炎病毒DNA P结构域的功能研究

文献综述二 酵母双杂交系统研究进展

附录一主要仪器设备

附录二英文缩略词

致谢