大环内酯类药物对铜绿假单胞菌密度感知系统1as基因和相关致病因子的影响

摘要

目的：本课题通过对比铜绿假单胞菌野生株PAOl及密度感知系统(QS)las和rhl基因缺失的双变异株PAO-JP2的生物学特性，探讨QS系统对铜绿假单胞菌致病性、耐药性的影响；并通过对经罗红霉素、阿奇霉素、乙酰螺旋霉素处理后的PAOl、PAO-JP2生物被膜的形态、致病因子以及lasR基因转录水平比较，探讨阿奇霉素等大环内酯类药物对QS系统在铜绿假单胞菌生物被膜致病性、生物被膜的形成以及在转录水平干扰密度感知信号因子AHL的合成的影响。 方法：采用改良的组织培养平板法建立PAOl及PAO-JP2生物被膜模型；应用银染法快速鉴定进行PAOl及PAO-JP2生物被膜形态学的比较，采用计算机图像处理系统对银染法快速鉴定后的硅胶片进行图像分析；应用琼脂平板稀释法测定3种大环内酯类药物对PAOl、PAO-JP2的MIC值：应用PTSB培养基培养及酶．底物反应后测量吸光度值观察大环内酯类药物对铜绿假单胞菌胞外毒力因子弹性蛋白酶(elastase，El)的影响；应用TSBD培养基培养应用SDS-PAGE以及Westem-Blot技术观察大环内酯类药物对铜绿假单胞菌胞外毒力因子外毒素(toxA)的影响；应用M-H琼脂平板培养、TRizol法提取RNA利用反转录技术(RT-PCR)观察大环内酯类药物对lasR基因转录水平上的影响。 结果：应用银染法快速鉴定及计算机图像处理系统分析观察不同浓度罗红霉素、阿奇霉素、乙酰螺旋霉素处理的PAOl、PAO0-P2生物被膜，可见随着罗红霉素、阿奇霉素浓度增大(20ug/ml，40ug/ml，80ug/ml)，PAOl、PAO-JP2生物被膜菌逐渐被清除，细菌量逐渐减少，同一浓度下，对PAOl较PAO-JP2清除明显，乙酰螺旋霉素处理组此现象不明显；PTSB培养基培养及酶-底物反应后测量吸光度值观察大环内酯类药物对铜绿假单胞菌弹性蛋白酶的影响可见随着阿奇霉素、罗红霉素的浓度增加，吸光度值呈下降趋势，乙酰螺旋霉素处理组此现象不明显；TSBD培养基培养应用SDS-PAGE以及Westem-Blot技术观察大环内酯类药物对铜绿假单胞菌外毒素的影响，可见随着罗红霉素、阿奇霉素的浓度增加，外毒素条带灰度减弱示其生成呈下降趋势，乙酰螺旋霉素处理组此现象不明显；利用反转录技术(RT-PCR)观察大环内酯类药物对lasR基因转录水平上的影响可见lasR基因转录随着阿奇霉素的浓度增加，lasR条带灰度减弱示其生成呈下降趋势，PAO-JP2组未发现lasR条带。 结论：铜绿假单胞菌是产生细菌生物被膜主要致病菌。本研究发现大环内酯类药物在生物被膜培养过程中分别处理PAOl、PAO-JP2，结果提示大环内酯类药物(14、15元环)通过对QS系统的影响可有效抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成；通过QS系统有效抑制铜绿假单胞菌的毒力因子的产生，16元环的大环内酯类药物乙酰螺旋霉未见上述结论；lasR基因的反转录络果提示阿奇霉素可在转录水平抑制QS系统发挥其作用。综上所述，本研究发现大环内酯类药物阿奇霉素通过抑制铜绿假单胞菌QS系统的lasR基因转录，有效的抑制相关致病因子弹性蛋白酶和外毒素的表达，同时抑制铜绿假单胞菌细菌生物被膜的形成。

目录

论文说明：英文缩略语表

声明

摘要

前 言

第一部分大环内酯类药物对铜绿假单胞菌PA01、PAO-JP2生物被膜形态学的影响

材料

方法

结 果

讨 论

第二部分大环内酯类药物对铜绿假单胞菌致病因子的影响

第一节大环内酯类药物对铜绿假单胞菌弹性蛋白酶的影响

材料与方法

结 果

第二节大环内酯类药物对铜绿假单胞菌外毒素A的影响

材料与方法

方法

结 果

讨 论

第三部分阿奇霉素对铜绿假单胞菌lasR基因转录水平的影响

材料

方法

结 果

讨 论

结论

主要创新点

参考文献

综述 铜绿假单胞菌生物被膜密度感知系统分子机制的研究进展

攻读学位期间发表论文

致谢