第一部分：人类肠道病毒分子生物学分型鉴定方法的建立及应用;第二部分：乙型肝炎病毒多表位抗原酵母表达质粒的构建

摘要

第一部分人类肠道病毒分子生物学分型鉴定方法的建立及应用。 人类肠道病毒(HEV)是小核糖核酸病毒科的一个属，文献报道的HEV已有91个型，分为脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A组、B组病毒、埃可病毒和新型肠道病毒5个组。人类肠道病毒感染大多表现为隐性感染或症状轻微，但也可以引起无菌性脑膜炎、弛缓性麻痹、急性心肌炎、手足口病等严重疾病。常规的HEV鉴定多采用病毒分离结合中和试验等血清学方法，由于HEV血清型繁多，血清学分型鉴定费时费力。本研究的目的在于建立人类肠道病毒分子生物学分型鉴定方法，用于临床分离肠道病毒的分型鉴定。 根据已知各型别人类肠道病毒基因的核苷酸序列和文献资料，分别合成1对HEV种属特异性引物“EV1/EV2”和5对分型鉴定引物“P1/P2”、“P1/P3”、“P4/P7”、“P5/P7”和“P6/P7”，提取病毒RNA，采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增病毒cDNA，通过琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列分析，建立了人类肠道病毒的分子生物学分型鉴定方法。采用该方法鉴定了18株疑似HEV毒株，并与血清中和试验相互验证。结果表明，经种属特异性引物鉴定，其中17株为人类肠道病毒；采用型特异性引物进行分型鉴定，其中4株为科萨奇病毒A24型，3株为科萨奇病毒B3型；科萨奇病毒B2、A9、A15型、埃可病毒3、6、7、9、11、14、33型和鼻病毒9型各1株，微量中和试验结果与分子生物学方法分型结果完全符合。 本实验组合运用了上述6对HEV鉴定和分型引物，对全部引物的PCR扩增体系和扩增条件进行了统一，可以显著节约病原学检出时间，同时可以确定流行株可能发生的基因变异情况，与传统的病毒分离和血清学鉴定分型方法相比具有特异性强、敏感性高、快速简便等优点，可以直接鉴定并分型诊断人类肠道病毒感染，适用于人类肠道病毒感染的实验室诊断和流行病学研究。 第二部分乙型肝炎病毒多表位抗原酵母表达质粒的构建。 慢性乙型肝炎是一种严重的病毒性疾病，虽然近年来抗HBV治疗有了很大进展，但由于治疗性药物难以彻底清除乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)，而且具有停药易复发，易引起病毒变异等缺点，所以打破慢性乙肝患者对HBV的免疫耐受，提高特异性免疫功能目前被认为是有望彻底治愈HBV慢性感染的根本措施。本实验以HBVHBc作为免疫呈现载体，选取毕赤巴斯德酵母(Pichia.pastoris)外源基因表达系统表达乙型肝炎病毒不同免疫表位嵌合抗原，以期用于治疗慢性乙肝患者，增强乙肝病毒各抗原表位的免疫原性和抗原性，打破耐受、重建免疫应答，激发慢性乙肝患者体内产生中和抗体和以细胞毒性T细胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL)应答为主的细胞免疫应答，以达到清除肝细胞内病毒的目的。 本实验选取adr亚型乙肝病毒DNA作为扩增模板，扩增获得编码HBV核心抗原(HBVcoreantigen,HBc)1-78aa、HBc79-149aa、preS1抗原10-50aa、preS2抗原110-154aa及S抗原101-157aa的五个基因片段。通过将HBc1-78aa和HBc79-149aa两个基因片段酶切连接并插入质粒pPIC3.5k构建了以HBc为呈现载体的酵母表达质粒pPIC3.5kHBc。将扩增获得的preS1、preS2和S三个基因片段插入质粒pGEM-T/HBc2获得融合基因片段S1C、S2C和SC，之后将融合基因片段插入质粒pPIC3.5k，构建了酵母表达质粒pPIC3.5kHBcS1、pPIC3.5kHBcS2和pPIC3.5kHBcS。 将表达质粒pPIC3.5kHBcA、pPIC3.5kHBcS1和pPIC3.5kHBcS2以SalI核酸内切酶线形化，电穿孔转化GS115酵母细胞，利用无氨基酸的酵母含氮碱基作为唯一氮源筛选获得阳性转化子。通过G418加压筛选，获取了可以高效表达融合蛋白的多拷贝整合菌株。 对筛选出的多拷贝整合菌株进行甲醇利用表型鉴定，全部菌株均为甲醇利用正常型(Mut+)。对所选菌株提取酵母基因组DNA，以PCR方法鉴定转化子，确定全部菌株均整合了酵母表达质粒。 本研究构建了pPIC3.5kHBcA、pPIC3.5kHBcS1和pPIC3.5kHBcS2三个酵母表达质粒，并将其以高拷贝整合于Pichia.pastoris酵母表达系统，为下一步的诱导表达及融合蛋白的免疫原性研究奠定了基础。

目录

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第一部分：人类肠道病毒分子生物学分型鉴定方法的建立及应用：中文摘要

第一部分：人类肠道病毒分子生物学分型鉴定方法的建立及应用：英文摘要

第一部分：人类肠道病毒分子生物学分型鉴定方法的建立及应用：前言

第一部分：人类肠道病毒分子生物学分型鉴定方法的建立及应用：实验材料

第一部分：人类肠道病毒分子生物学分型鉴定方法的建立及应用：实验方法

第一部分：人类肠道病毒分子生物学分型鉴定方法的建立及应用：实验结果

第一部分：人类肠道病毒分子生物学分型鉴定方法的建立及应用：讨论

第一部分：人类肠道病毒分子生物学分型鉴定方法的建立及应用：小结

第一部分：人类肠道病毒分子生物学分型鉴定方法的建立及应用：参考文献

第二部分：乙型肝炎病毒多表位抗原酵母表达质粒的构建：中文摘要

第二部分：乙型肝炎病毒多表位抗原酵母表达质粒的构建：英文摘要

第二部分：乙型肝炎病毒多表位抗原酵母表达质粒的构建：前言

第二部分：乙型肝炎病毒多表位抗原酵母表达质粒的构建：实验材料

第二部分：乙型肝炎病毒多表位抗原酵母表达质粒的构建：实验方法

第二部分：乙型肝炎病毒多表位抗原酵母表达质粒的构建：实验结果

第二部分：乙型肝炎病毒多表位抗原酵母表达质粒的构建：讨论

第二部分：乙型肝炎病毒多表位抗原酵母表达质粒的构建：小结

第二部分：乙型肝炎病毒多表位抗原酵母表达质粒的构建：参考文献

文献综述 临床标本中肠道病毒RT-PCR检测及分型鉴定研究进展

攻读学位期间发表文章情况

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