Caveolae/caveolin-1在低切应力引发乳腺癌细胞转移的力学生物学机制研究

摘要

乳腺癌的复发和转移是导致女性死亡的主要原因。有研究表明，循环肿瘤细胞不仅可以克服甚至可以利用低切应力的力学微环境进行转移。Caveolin-1(Cav-1)通常定位在细胞膜脂筏部位和caveolae区域，参与完成多种功能，其中包括内吞、转胞吞、胆固醇平衡、机械力传导、细胞信号转导和细胞增殖等。Cav-1的N-末端第14位残基被络氨酸激酶磷酸化后，参与粘着斑的动态变化、细胞的定向迁移、ECM重组和内吞等。Cav-1具有一个脚手架结构域(Caveolin Scaffolding Domain，CSD)，可以与多种蛋白相结合，如Ras/MEK/ERK、G蛋白、PI3K和JAK/STAT等，协助Cav-1与下游信号分子之间的相互作用。有研究表明，caveolae/Cav-1是细胞膜上的一种力学感受器，能对机械拉力和低切应力做出快速反应，但其具体机制仍不清楚。因此，本研究采用平行板流动腔系统(parallel-plate flow chamber system)模拟癌细胞转移过程中的力学微环境，深入探究caveolae/Cav-1是如何介导低切应力引起癌细胞迁移，及其力学信号转导机制。
　　在本研究中，选用高转移性的乳腺癌MDA-MB-231细胞为研究对象。实验结果表明，1.8dyn/cm2和4 dyn/cm2切应力上调了Cav-1的表达，并且可以活化Cav-1 Tyr-14。划痕实验和侵袭伪足形成实验结果证实，低切应力能够促进癌细胞的迁移和侵袭形成。采用PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂处理细胞之后，细胞迁移能力明显被抑制。然而，用MβCD破坏脂筏结构会抑制Cav-1的磷酸化，抑制了下游PI3K/Akt信号通路的活化。低切应力处理会增加 Cav-1在脂筏部位的聚集，增加Cav-1与p85亚基的结合从而活化下游的信号通路。进一步研究发现，低切应力作用还会上调MT1-MMP的表达，引发Cav-1与MT1-MMP共定位于侵袭伪足部位，并大量聚集。进一步通过 Cav-1沉默，会显著降低 MT1-MMP表达，抑制MDA-MB-231细胞的转移，还会导致下游p85和Akt的磷酸化降低。将转染Cav-1 shRNA沉默Cav-1和转染Cav-1 Y14D的稳定细胞系接种的小鼠尾静脉，建立小鼠肺转移模型实验结果表明，Cav-1沉默可以降低癌细胞向肺部的转移，而转染Cav-1 Y14D的细胞转移能力明显增加。我们的研究表明，在乳腺癌MDA-MB-231细胞中，caveolae/Cav-1和其下游的信号分子介导低切应力信号传入胞内，促进癌细胞的转移。

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第一章 绪 论

1.1乳腺癌的高转移性

1.2 CTCs在毛细血管中的低切应力的力学微环境

1.3 Caveolae和caveolin-1

1.4侵袭性伪足与肿瘤转移

1.5本课题的立题依据、研究内容和意义

第二章 实验材料与方法

2.1实验材料与方法

2.2软件及统计分析

第三章 结果分析与讨论

3.1低切应力能够上调Cav-1的表达和活化

3.2低切应力能够促进乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞的迁移

3.3低的切应力能够促进Cav-1在lipid rafts上的定位

3.4低的切应力能够促进高转移能力细胞Cav-1向lipid rafts的定位

3.5低切应力能够促进乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞的侵袭

3.6脂筏的完整性对于Cav-1的活化和基质降解具有重要作用

3.7低切应力能够影响MT1-MMP的表达

3.8低切应力促进PI3K/Akt信号通路活化

3.9慢病毒转染沉默Cav-1，抑制PI3K/Akt下游信号通路活化，降低细胞的运动能力

3.10 沉默Cav-1对Cav-1和MT1-MMP在细胞膜上共定位的影响

3.11 采用抑制剂抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路之后对MT1-MMP的表达影响

3.12 慢病毒转染沉默Cav-1及Cav-1 Y14D，对细胞骨架的影响

3.13 慢病毒转染沉默Cav-1及Cav-1 Y14D，对癌细胞肺转移的影响

3.14 慢病毒转染沉默Cav-1及Cav-1 Y14D，对转移灶形成和Cav-1和MT1-MMP表达的影响

第四章 结论与展望

4.1 全文总结

4.2 后续工作展望

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间取得的成果

附录