粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对小鼠急性肝衰竭的治疗作用及抗凋亡机制研究

摘要

目的:观察粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)对D-半乳糖胺/脂多糖(D-GalN/LPS)所致小鼠急性肝衰竭的保护作用,探讨G-CSF在肝衰竭中治疗作用及其抗凋亡可能机制。
　　方法:
　　1、采取腹腔注射D-GalN/LPS制造小鼠急性肝衰竭模型。选取三个可能影响造模成功率的指标为实验因素:D-GalN剂量、LPS剂量、稀释倍数,每个实验因素选取四个水平,利用L16(43)正交表安排试验,以小鼠24h病死率为考察指标。观察小鼠血清ALT、肝组织学改变,肝脏细胞凋亡验证造模效果,确定D-GalN、LPS致小鼠肝衰竭的理想剂量搭配。
　　2、腹腔注射D-GalN(350mg/kg)/LPS(30μg/kg)制造小鼠急性肝衰竭模型。将雄性C57/BL6小鼠随机分为对照组、治疗组及正常对照组。治疗组在肝衰竭造模前96h、72h、48、24H和0H皮下注射重组人G-CSF(250mg/kg体重),对照组在相应时间点皮下注射无菌生理盐水0.2ml/只。通过检测比较各组小鼠生存率、不同时间点血清ALT水平、肝组织损伤程度证明G-CSF对急性肝衰竭小鼠保护作用;采用TUNEL染色方法检测小鼠肝组织中细胞凋亡,明确G-CSF具有减少细胞凋亡作用。使用Real-timePCR方法观察肝组织中Bcl-2、Bcl-xlmRNA表达变化。蛋白免疫印迹(Western blot)检测小鼠肝组织Bcl-2表达,进一步探讨G-CSF抗凋亡作用机制。
　　结果:
　　1、经方差分析造模中各因素作用主次为:D-GalN剂量>LPS剂量>稀释倍数,D-GalN剂量为350mg/kg、LPS剂量为30μg/kg、原液稀释三倍为理想造模条件。经检测小鼠ALT值、造模后肝组织HE染色以及TUNEL染色证明上述优化条件造模后符合急性肝衰竭模型。
　　2、G-CSF对D-GalN/LPS所致小鼠急性肝衰竭具有治疗作用:G-CSF治疗可提高D-GalN/LPS所致小鼠急性肝衰竭生存率,治疗组小鼠24小时生存率为40％,高于对照组15%(χ2=3.989,P=0.046);造模后6h,治疗组小鼠血清ALT水平显著低于对照组(681.0±113.2VS1371±210.9t=2.882,P=0.044);HE染色结果示对照组小鼠肝小叶结构破坏,肝索解离,肝细胞崩解、弥漫性大片坏死,残存肝细胞肿胀,大量炎性细胞浸润。G-CSF治疗组小鼠肝组织小叶结构紊乱但仍可辨,可见大量细胞肿胀,炎细胞浸润,无弥漫性大片坏死,未见肝索解离,未见大量小叶内出血。G-CSF抑制D-GalN/LPS致急性肝衰竭造模小鼠肝细胞凋亡:造模后6h,肝组织中TUNEL染色阳性细胞计数,治疗组亦低于对照组(654±64.29VS1155±192.6t=2.467P=0.033);造模后6H经G-CSF治疗组抗凋亡基因Bcl-2表达高于对照组(4.793±0.900VS2.093±0.733;P=0.017),抗凋亡基因Bcl-xl表达同为治疗组高于对照组(0.412±0.095VS0.162±0.0737P=0.027)。
　　结论:G-CSF可通过抑制肝组织细胞凋亡的方式对小鼠急性肝衰竭起到治疗作用,其抗凋亡作用可能通过上调肝组织内Bcl-2、Bcl-xl实现的。

目录

封面

声明

目录

英文缩略词表

中文摘要

英文摘要

前言

正文

第一部分 D-半乳糖胺/脂多糖（D-GalN/LPS）所致小鼠急性肝衰竭模型正交试验优化研究

引言

1 设备与材料

1.1实验动物

1.2主要试剂和耗材

1.3仪器设备

2 实验方法

2.1正交实验设计

2.2 动物分组及处理

2.3 造模稳定性

2.4 小鼠血清ALT检测

2.5 小鼠肝脏HE染色

2.6 肝组织末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿嘧啶缺口末端标记（TUNEL）检测

2.7 统计学分析

3 结果

3.1 正交试验结果

3.2 造模稳定性

3.3 血清ALT变化

3.4 HE染色示组织学变化

3.5 细胞凋亡的TUNEL分析

4 讨论

第二部分 粒细胞集落刺激因子（G-CSF）对小鼠急性肝衰竭的治疗作用及抗凋亡机制研究

引言

1 设备与材料

1.1 实验动物

1.2 主要试剂和耗材主要试剂和耗材

1.3仪器设备

1.4试剂配制

2 实验方法

2.1实验分组

2.2动物给药、造模

2.3标本留取及处理

2.4血清谷氨酸丙氨酸氨基转移酶（ALT）检测

2.5肝组织HE染色

2.6 D-GalN/LPS造模后24h生存率分析

2.7 TUNEL检测

2.8蛋白免疫印迹（Western blot）检测

2.9 肝组织Bcl-2、Bcl-xLmRNA表达real-time PCR检测。

3. 结果

3.1 D-GalN/LPS造模后小鼠24h生存率分析

3.2 血清ALT水平比较

3.3 肝组织损害程度比较

3.4 肝组织TUNEL染色结果

3.5肝组织中BCL-2、BCL-xL基因mRNA表达水平

3.5 Bcl-2蛋白免疫印迹（Western blot）检测

4.讨论

5.结论

参考文献

文献综述

攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢