一种抗新生血管的肽体药物设计与评估

摘要

计算机辅助药物设计(computer aided drug design,CADD)通过计算机模拟、计算和预测药物分子与受体之间的相互作用,是新药设计、开发和优化的重要技术手段.多肽(peptide)是氨基酸通过肽键的形式连接形成的一种短链化合物,在机体调节等方面发挥重要作用.多肽具有特异性强、亲和力高及容易制备等优点,近年来在临床治疗、药物开发等领域有着广泛的应用.为了克服多肽在体内稳定性较差和半衰期较短等不足,研究人员采用多种方法对多肽进行修饰改进,其中一个有效的策略就是将多肽与免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)中的可结晶片段(fragment crystallizable,Fc)进行连接构建融合蛋白,称之为肽体(peptibody).肽体可以有效地延长多肽分子的血清半衰期,改善稳定性和溶解度等特性,制备工艺和纯化流程简单,可以有效降低药物成本. 眼底新生血管性疾病是一类因视网膜和脉络膜中血管畸形增生而引发的眼科疾病,新生血管性年龄相关性黄斑病变(age-related macular degeneration,AMD)是造成50岁以上老年人视力下降甚至失明的重要原因.在新生血管性AMD中,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一个重要因素,VEGF可以与细胞表面的血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)结合诱导血管形成,从而引发相关疾病.目前抗VEGF/VEGFR通路的药物对治疗新生血管性疾病有着较好的治疗效果.但现有的抗VEFG药物存在产能较低、成本较高、治疗效果欠佳以及注射治疗风险较高等问题,因此研发一款低成本、高效能、无创或微创方式治疗眼底新生血管性疾病的新药迫在眉睫. 为了响应抗VEGF新药研发的需求,我们通过生物淘选(biopanning)从噬菌体展示(phage display)肽库中筛选出具有抗血管生成活性的多肽,利用计算机辅助药物设计方法设计了具有抗新生血管功能的新型肽体药物,并对其与VEGFR的相互作用、免疫原性等进行了评估.课题的主要研究内容如下: 1、通过生物淘选获得了具有抗血管生成活性的功能多肽.本研究构建了VEGFR-Fc融合蛋白,利用该融合蛋白对Ph.D-12噬菌体展示肽库进行筛选,通过测序获得了一组VEGFR-Fc结合多肽,利用靶标无关多肽(Target-unrelated peptides,TUP)筛选工具等去除掉噪声干扰,获得了具有VEGFR-Fc融合蛋白结合能力的多肽HRH(HRHTKQRHTALH). 2、设计生物实验验证了HRH多肽的新生血管抑制作用.为了验证HRH多肽的抗血管生成活性,研究中设计了人脐静脉内皮细胞增殖实验、体内鸡胚绒毛尿囊膜实验以及大鼠眼角膜损伤动物模型等体内外生物实验,实验结果表明HRH多肽可以竞争性抑制VEGF和VEGFR结合,具有抗新生血管的活性. 3、以HRH多肽为基础设计构建了具有抗血管生成活性的肽体PbHRH.我们以FDA批准的第一个肽体药物罗米司亭(Romiplostim)为模板,用HRH多肽替换掉罗米司亭中功能区域AF12505多肽,构建了新的抗新生血管肽体药物并命名为PbHRH. 4、对PbHRH及其和VEGFR之间的相互作用进行了评估.采用分子对接、分子模拟等方法对PbHRH肽体结构、VEGFR结合位点、结合自由能等进行了预测和分析,结果表明将HRH多肽与Fc区域融合形成肽体不会影响其抗新生血管活性,肽体会改善其药代动力学性状. 5、评估了PbHRH肽体的免疫原性并提出了肽体药物免疫原性评估的有效流程.采用T细胞表位预测的策略,设置罗米司亭作为阴性对照,使用免疫表位数据库IEDB(immune epitope database)及其在线预测分析工具对PbHRH的MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ亲和力以及MHC-Ⅰ、CD4T细胞免疫原性等进行了预测和分析,结果表明理论上PbHRH与罗米司亭具有相似的低免疫原性.以该工作为基础,提出了在肽体药物设计中免疫原性评估的有效流程,并通过多个肽体的免疫原性预测进行了验证. 综上,本课题利用噬菌体展示技术淘选到一个具有抗新生血管活性的功能多肽HRH,并以此为基础设计构建了一款抗VGEF的新型肽体药物,利用分子对接、分子模拟对肽体结构以及其与VEGFR的相互作用进行了预测和分析,并评估了药物的免疫原性.总之,本课题设计的PbHRH肽体具有治疗眼底新生血管性疾病的潜力,我们的工作为该药物的进一步研发提供了基础,具有重要的科学意义和广阔的应用前景.

目录

声明

第一章 绪 论

1.1 计算机辅助药物设计

1.2多肽与医学应用

1.3 肽体

1.4 肽体药物设计

1.4.1 功能多肽的获取

1.4.2 Fc片段选择和设计

1.4.3 融合方式选择

1.4.4 免疫原性评估

1.4.5 小结

1.5 眼底新生血管性疾病

1.5.1 新生血管性年龄相关性黄斑变性AMD

1.5.2 血管内皮生长因子

1.5.3 抗VEGF药物现状

1.5.4 小结

1.6本文的主要研究内容及结构安排

第二章 抗新生血管多肽的筛选和验证

2.1 引言

2.2.1材料

2.2.2 生物淘选

2.2.3 噬菌体ELISA实验

2.2.4 VEGFR-Fc结合肽合成和鉴定

2.2.5 人脐静脉内皮细胞增殖实验

2.2.6 鸡胚绒毛尿囊膜实验

2.2.7 体内抗血管新生作用的验证

2.2.8 数据分析和统计

2.3.1 与VEGFR-Fc融合蛋白结合的噬菌体的亲和性选择和序列分析

2.3.2 HRH多肽抑制人脐静脉内皮细胞的增殖

2.3.3 HRH抑制鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成

2.3.4 HRH抑制碱灼伤大鼠角膜新生血管模型中的新血管生成

2.3.5 HRH抑制缝线诱导大鼠角膜新生血管模型中的新生血管生成

2.4 本章讨论

2.4.1 HRH多肽抗血管新生功能及机制的研究

2.4.2 生物淘选在HRH多肽筛选中的应用

2.4.3 抗血管新生肽HRH的应用前景

2.5 本章小结

第三章 HRH肽体药物的设计与评估

3.1 引言

3.2.1 设计模板

3.2.2 分子动力学模拟

3.2.3结合自由能分析

3.3实验结果

3.3.1 HRH多肽结构建模

3.3.2 PbHRH肽体的结构建模

3.3.3 PbHRH-VEGFR-1复合体结构建模

3.3.4 PbHRH-VEGFR-1复合体结合自由能分析

3.3.5 HRH-VEGFR-1复合体分析

3.4 本章讨论

3.4.1 PbHRH肽体的构建

3.4.1 PbHRH肽体的结构及作用机制研究

3.4 本章小结

第四章 PbHRH肽体免疫原性评估

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 MHC-Ⅰ类分子亲和力预测

4.2.2 MHC-Ⅱ类分子亲和力预测

4.2.3 MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ免疫原性预测

4.3 实验结果

4.3.1 PbHRH和罗米司亭MHC-Ⅰ类分子亲和力预测结果

4.3.2 PbHRH和罗米司亭MHC-Ⅱ类分子亲和力预测结果

4.3.3 PbHRH和罗米司亭MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ免疫原性预测结果

4.3.4 PbHRH预测表位HLA等位基因人群分布分析

4.3.5 AMG819免疫原性评估结果

4.3.6 Ang2肽体免疫原性评估结果

4.4 本章讨论

4.4.1 PbHRH肽体免疫原性评估

4.4.2 MHC分子亲和力预测及免疫原性预测

4.4.3 肽体药物免疫原性评估的有效流程

4.4 本章小结

第五章 全文总结与展望

5.1 全文总结

5.2 后续工作展望

致谢

参考文献

附录

附录Ⅰ

附录 Ⅱ

攻读博士学位期间取得的成果