复方肾华片对肾缺血再灌注损伤大鼠肾脏保护作用及对Toll样受体信号通路的研究

摘要

目的:缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)是指组织或器官在缺血的基础上恢复血流后,细胞功能代谢发生障碍及结构损伤反而加重的现象。急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)是临床的常见疾病,其患病率逐年攀升,AKI的定义为48h内血肌酐(Serum creatinine,Scr)升高≥26.5umol/L;或者Scr增加≥基线值的1.5倍;或持续6h尿量<0.5ml/kg·h。其发病机制尚未完全清楚。肾IRI是导致缺血性AKI的主要原因之一。研究表明,免疫炎症反应是IRI的重要机制之一,其中炎性受体发挥着重要作用。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是近年来发现的I型跨膜蛋白受体。它可以针对不同病原相关分子模式或损伤相关分子模式进行识别、结合,引发一系列细胞内信号传导,进而导致炎性介质的释放,最终导致免疫炎症反应的发生。
　　有证据表明TLRs是参与激发缺血后免疫炎症反应的主因,是组织损害的关键性传感器。大量的实验数据支持TLRs作为炎症和自身免疫性疾病的一个新靶点。阻断或抑制TLRs信号通路节点药物研究已成为医学领域的热点。但目前西药对肾IRI的防治尚无有效的方法。千百年来中药在辨证治疗方面发挥了不可或缺的作用,中药方剂的功效研究正吸引世界各地学者越来越多的关注。
　　本文通过建立大鼠肾IRI模型,探讨中药复方制剂复方肾华片(Fufang Shenhua Tablet,SHT)高、低两种剂量对IRI模型大鼠发生的AKI的肾脏保护作用,同时观察IRI术后1周内Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)和Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)及相关的炎症细胞因子的蛋白及mRNA表达,以及TLRs信号传导通路中髓样细胞分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)的蛋白及mRNA表达。从TLRs信号传导通路改变上来揭示SHT对IRI大鼠的肾脏保护作用及其可能的机制。
　　方法:(1)首先通过采用无创动脉夹夹闭大鼠的双侧肾蒂方式来建立Wistar大鼠肾IRI模型,根据肾脏缺血的时间不同,大鼠随机分成假手术组(Sham组)、20min组、30min组、40min组及50min组,缺血再灌注1d后用全自动生化测定仪检测大鼠血肌酐(Serumcreatinine,Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN);大鼠肾脏组织制作石蜡切片,PAS染色后光学显微镜下观察肾小管的损伤程度。用显微图像采集分析系统对大鼠肾脏病理组织形态学的变化和肾小管损伤程度进行评分,比较不同的缺血时间对肾脏的上述指标的影响;同时进行大鼠肾缺血50min组的术后1周生存率观察。在确定理想的大鼠肾缺血时间后,将Wistar大鼠随机分成两组,一组将右侧肾切除,左侧肾蒂夹闭;另一组行双侧肾蒂夹闭。观察术后1d、3d、5d、7d血肌酐、尿素氮变化以及术后1周大鼠生存率,绘制生存率曲线。筛选出理想的大鼠IRI模型所需的术式和肾蒂缺血夹闭时间。
　　(2)将大鼠随机分为4组:假手术组(Sham)、模型对照组(Model)、复方肾华片低剂量组(SHT-L)和复方肾华片高剂量组(SHT-H)。给予治疗药物每天灌胃1次,7天后采用双侧肾蒂夹闭40min方法建立肾IRI模型,观察大鼠术后24h和72h生命体征;用全自动生化测定仪检测血BUN、Scr;光学显微镜下观察大鼠肾组织的肾小管损伤程度,并用计算机显微图像采集分析系统对肾小管损伤程度进行评分。观察和评估复方肾华片(SHT)的肾脏保护作用。
　　(3)将大鼠随机分为5组:假手术组(Sham)、模型对照组(Model)、黄芪甲苷组(Astragaloside)、复方肾华片低剂量组(SHT-L)和复方肾华片高剂量组(SHT-H)。给予相应药物每天灌胃1次,7天后采用右肾切除,左侧肾蒂夹闭40min方法建立肾IRI模型,观察术后24h和72h大鼠的生命体征;用全自动生化测定仪检测血BUN、Scr;光学显微镜下观察大鼠肾组织的肾小管损伤程度,并用显微图像采集分析系统对肾小管损伤程度进行评分;JEM-1400型电子显微镜观察肾小管上皮细胞超微结构变化,并作量化分析。
　　(4)将大鼠随机分为5组:假手术组(Sham)、模型对照组(Model)、黄芪甲苷组(Astragaloside)、复方肾华片低剂量组(SHT-L)和复方肾华片高剂量组(SHT-H),分别给予相应药物灌胃7天后,采用右侧肾切除,左侧肾蒂夹闭40min法建立缺血再灌注模型,通过石蜡切片免疫组织化学ABC法(Immunohistochemistry,IHC-P)、蛋白印迹法(Western blot,WB)和ABI7900HT实时荧光定量核酸扩增检测系统(Real-time quantitative PCR detecting system,qPCR)检测大鼠术后1d、3d、5d、7d肾组织Toll样受体2(Toll-likereceptors2,TLR2)、Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)和白细胞介素-12(interleukin 12,IL-12)蛋白分子及其mRNA水平表达,白细胞介素-8(interleukin 8,IL-8)和干扰素-γ(IFN-gamma,IFN-γ)的蛋白表达情况。
　　结果:(1)实验中手术造模成功率达97.6％,与Sham组相比,双侧肾蒂夹闭30min组,再灌注1d后血尿素氮、肌酐及肾脏病理损害评分均升高(P<0.05),而20min组上述指标均无显著性差异(P>0.05)。与Sham组相比,双侧肾蒂夹闭40min组和50min组,再灌注1d后血尿素氮、肌酐和肾脏病理损害评分均显著异常(P<0.01)。右侧肾切除,左侧肾蒂夹闭组与双侧肾蒂夹闭组比较,术后1周两组间血肌酐和生存率无显著差异(P>0.05)。肾缺血50min组的生存率下降显著,仅为50%。
　　(2)与Sham组相比,术后24h和72h,Model组大鼠的肾功及肾脏病理均显著异常(P<0.01)。与Model组相比,术后24h和72h,SHT-L组大鼠的肾功及肾组织病理损害均减轻(P<0.05),SHT-H组肾功及肾组织病理损害减轻更明显(P<0.01);SHT-H组大鼠的肾功及肾组织病理损害均轻于SHT-L组(P<0.05)。
　　(3)IRI术后24h,肾功、肾脏光镜和电镜病理损害达峰值,术后72h上述指标均得到部分恢复。术后24h和72h,Astragaloside组和SHT-L组肾功、肾脏光镜和电镜病理损害均较Model组显著改善(P<0.05),SHT-H组改善更显著(P<0.01);Astragaloside组和SHT-L组上述指标结果相似(P>0.05),SHT-H组上述指标改善程度优于Astragaloside组和SHT-L组(P<0.05)。
　　(4)与Model组相比,大鼠IRI术后1d、3d、5d、7d,Astragaloside组和SHT-L组TLR2和TLR4蛋白分子及mRNA表达均降低(P<0.05),SHT-H组TLR2和TLR4蛋白分子及mRNA表达下降最显著(P<0.01)。各组大鼠IRI术后5dTLR2和TLR4蛋白分子及mRNA表达均达峰值;与Astragaloside组和SHT-L组比较,IRI术后1d、3d、5d、7d,SHT-H组TLR2和TLR4蛋白分子及mRNA表达均明显下降(P<0.05);Astragaloside组和SHT-L组TLR2和TLR4蛋白分子及mRNA表达无差异(P>0.05)。与Model组相比,大鼠IRI术后1d、3d、5d、7d,Astragaloside组、SHT-L组和SHT-H组IL-6、IL-12和MyD88蛋白分子及mRNA表达均显著降低(P<0.05)。术后1dIL-8和TNF-γ蛋白表达水平最高,术后3dIL-6、IL-12蛋白分子及mRNA表达水平达峰值,术后5d各组MyD88蛋白分子及mRNA表达水平达峰值。术后1d、3d、5d、7d,与Astragaloside组和SHT-L组比较,SHT-H组MyD88蛋白分子及mRNA表达,以及IL-8和IFN-γ蛋白表达均明显下降(P<0.05);Astragaloside组和SHT-L组比较,无论MyD88蛋白分子和mRNA表达,还是IL-8和TNF-γ蛋白表达,两组均无显著差异(P>0.05)。
　　结论:(1)采用无创动脉夹夹闭大鼠肾蒂的方法可以制备稳定的肾IRI模型,大鼠造模较为理想的肾缺血时间是40min,右侧肾切除,左侧肾蒂夹闭法与双侧肾蒂夹闭法造模均可行,术后生存率较高,所得模型效果满意。(2)无论是中药复方(SHT)还是单味中药(Astragaloside)均可明显改善肾IRI大鼠的生存质量,保护肾脏功能,减轻肾脏病理损害,其中低剂量SHT与Astragaloside疗效相似,但高剂量SHT疗效优于Astragaloside,提示中药复方优于单味中药。(3)SHT可抑制肾IRI大鼠免疫炎症受体TLR2和TLR4的蛋白分子及mRNA表达,SHT-H组抑制TLR2和TLR4蛋白分子及mRNA表达程度优于Astragaloside组和SHT-L组,提示SHT对免疫炎症受体TLR2和TLR4的作用也呈现出良好的剂量效应,(4)SHT可能通过调控MyD88依赖的TLRs信号传导通路,抑制了炎症细胞因子的释放,最终减轻和部分修复了IRI诱导的大鼠AKI,且疗效呈现良好的剂量效应。本研究提供了SHT防治缺血性AKI可能的TLRs信号传导通路机制。

目录

封面

声明

目录

英文缩写词表

中文摘要

英文摘要

第一部分 肾缺血再灌注损伤大鼠模型的建立与评价

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 复方肾华片对肾缺血再灌注损伤大鼠的保护作用

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 复方肾华片对大鼠肾缺血再灌注损伤病理损害及超微结构的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第四部分 复方肾华片对肾缺血再灌注损伤大鼠的Toll样受体表达的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第五部分 复方肾华片对肾缺血再灌损伤大鼠Toll样受体信号通路研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

文献综述

在学期间发表论文、课题及成果情况

致谢