麝香质量生物评价与控制方法的初步研究

摘要

中药质量评价与控制是保证中药安全有效的重要手段。生物测定已逐步成为中药质量标准研究和制定的重要发展方向。本研究以疗效确切、药效物质基础不明确的贵重药材麝香为研究对象，选择抗炎和抗菌活性，运用多种生物测定手段，初步建立了麝香质量生物评价方法，制订了人工麝香质量生物测定标准，并应用于不同产地的天然麝香及麝香伪品药材质量生物评定中。主要研究结果如下： 一、人工麝香抗炎生物效价检测方法研究。 （1）初步建立了基于环氧酶Ⅱ（COX-2）抑制检测的人工麝香抗炎效价测定方法（方法一）。采用酶免疫测定法（EIA），研究人工麝香对COX-2的抑制活性。结果表明，人工麝香对COX-2具有明显的抑制活性。并以COX-2抑制率（I%）为指标，以阿司匹林为对照，建立了人工麝香抗炎效价测定方法。结果显示，人工麝香的抗炎效价为81.1U/mg，可信限率为 20.0%。该方法用于人工麝香生物测定，具有与抗炎活性相关、灵敏、准确、重现性好等特点。 （2）初步建立了基于生物热活性检测的人工麝香抗炎效价测定方法（方法二）。在方法一研究基础上，采用生物热活性检测方法，研究人工麝香和COX-2的相互作用。结果表明，人工麝香和COX-2相互作用为放热反应，以COX-2为生物模型，以发热功率增加值（ΔP）为指标，以阿司匹林为对照，可建立人工麝香抗炎效价测定方法。初步解决了中药生物测定中的“怎么比”和“与谁比”的两个关键问题，但有待进一步研究。该方法与抗炎活性相关、灵敏、准确、重现性好，且与方法一相比，更为快速、简便、实用。 （3）初步建立了基于常规药理实验的人工麝香抗炎效价测定方法（方法三）。采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀的常规药理实验，评价人工麝香的抗炎活性。结果表明，人工麝香对小鼠耳廓肿胀具有明显的抑制作用；以肿胀率（S%）为指标，以阿司匹林为对照，建立了人工麝香抗炎效价测定方法。结果显示，人工麝香的抗炎效价为356.3 U/mg，可信限率为29.3%。该法测定结果与方法一测定结果基本一致，表明方法一得到了较好的验证。 二、人工麝香抗菌生物效价检测方法研究。 初步建立了基于生物热活性检测的人工麝香抗菌效价测定方法（方法四）。采用生物热活性检测方法，研究人工麝香对金黄色葡萄球菌生长代谢的影响。以金葡菌为生物模型，以最大发热功率出现的时间t2m为指标，以麝香酮为参照，建立了人工麝香抗菌效价测定方法。结果表明，人工麝香的抗菌效价为4.01U/mg，可信限率为15.3%。该方法与抗菌活性直接相关、快速、灵敏、重现性好、干扰因素少、简便实用。 三、方法的应用研究。 依据“相关性、特异性、重复性、灵敏性、定量化、快捷性、通用性、经济性、自动化、安全性”的中药质量生物测定方法遴选原则，以基于COX-2抑制活性检测的人工麝香抗炎效价测定和基于生物热活性检测的抗菌效价测定方法作为人工麝香质量生物测定的优选方法。并将上述生物测定方法应用于人工麝香、天然麝香及麝香伪品的生物效价测定。结果显示，8批麝香样品的抗炎效价平均值为34.35 U/mg（RSD=63.4％），可信限率均小于20.0%；抗菌效价平均值为1.32 U/mg（RSD=92.0％），可信限率均小于16.0%。结果表明，不同麝香样品的抗炎和抗菌效价差异较大，且人工麝香的抗炎和抗菌活性均明显强于其他样品，提示生物测定方法可以较好地评价麝香类药材的质量优劣。 四、麝香化学组分分析。 新建了UPLC－ELSD法，快速地对人工麝香、天然麝香及麝香伪品中麝香酮含量进行了测定。结果显示，除西藏产的两个麝香样品外，其他样品均含有麝香酮，含量在0.81％～2.41％之间，但未表现出明显的规律性。同时，建立了麝香化学指纹图谱分析方法。结果显示，8批麝香药材样品指纹图谱相似度平均值为0.931（RSD=6.7％）。提示化学分析方法用于麝香质量控制有待于进一步研究。 五、综合分析。 为了更深入地研究麝香药效活性与化学成分之间的相关性，对麝香生物效价与化学组分分析测定结果进行了相关分析。结果表明，麝香酮含量和抗菌效价呈正相关（r=0.7716），且具有显著性意义（P<0.05），提示麝香酮可能是麝香抗菌的主要有效成分之一；麝香酮含量和抗炎效价呈正相关（r=0.5023），但没有显著性意义（P>0.05），提示麝香酮可能不是麝香抗炎的主要有效成分之一，因此麝香酮含量高低不能反映麝香抗炎活性的大小；化学指纹图谱与抗菌和抗炎效价的相关性均不显著（P>0.05），提示化学指纹图谱和抗菌和抗炎效价没有直接的相关性；抗菌和抗炎效价无相关性（P>0.01），提示仅靠麝香酮含量测定和化学指纹图谱难以控制成分复杂的麝香的质量，同时抗炎与抗菌检定方法之间不能互相取代，而是互相补充，可共同对麝香进行质量评价与控制。 六、基于生物测定的人工麝香质量标准的制订。 在上述研究基础上，本文初步制订了人工麝香生物测定质量标准，为人工麝香生物测定方法和标准的实际应用提供了依据。研究结果表明，在现有药典常规和化学检测方法基础上，补充本文所建立的生物测定方法，共同把关人工麝香质量，可以有效地提高现有人工麝香质量控制水平，也为贵重中药的质量控制与评价提供了研究思路和技术参考。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章 绪 论

第二章 麝香样品的收集、常规检查与化学组分分析

第三章 人工麝香质量生物测定方法的建立

第四章 综合分析

第五章 基于生物测定的人工麝香质量标准初建

第六章 结语与展望

参考文献

附 录COX-2抑制活性检测操作规程

在读期间公开发表的学术论文（署名前两位）

博士期间参加课题研究情况表

致 谢