何首乌肝毒性客观性、临床标志物及损伤机制的初步研究

摘要

何首乌为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的块根，是著名的补益类中药，广泛用于补肝肾、乌发的中药制剂、保健食品、洗护发用品，以及大众日常餐饮、食疗保健等。一些商家炒作―人形何首乌延年益寿，近来备受民众追捧。然而，自2006年英国MHRA（药品与健康产品管理局）通报了何首乌制剂的肝损害案例并指出其具有安全性问题以来，国内外陆续出现了大量关于何首乌导致肝损害的报道，甚至有致死或肝移植案例。加拿大、英国、澳大利亚等国药品监管部门相继出台了对何首乌及含何首乌的制剂进行监管甚至限用的政策。
　　但是，何首乌肝毒性的客观真实性如何？是药物自身具有毒性，还是不合理用药造成的？能否在临床上早期辨识，进而早期干预，从而减少或降低毒副反应的发生？由于目前尚无对何首乌肝脏不良反应的系统性研究，更没有针对其早期诊断方法和指标的研究，制约了对何首乌及其制剂安全性进行科学监管及合理用药。考虑到何首乌广泛的使用人群以及其可能造成的肝脏严重不良反应，对何首乌肝毒性评价及其早期诊断进行深入研究已迫在眉睫。
　　为此，本课题充分发挥医院病例资源的优势，以临床病例资料和患者标本为主要研究对象，结合代谢组学、细胞毒理学及网络毒理学等方法，阐明何首乌肝毒性的客观真实性，筛选和研究何首乌肝毒性的可能成分、临床代谢标志物及其肝毒性的损伤机制，为评价何首乌肝毒性提供直接的临床数据，为何首乌肝毒性的早期诊断提供灵敏的辅助诊断指标，也为进一步指导何首乌临床合理用药减少其肝毒性的发生提供参考依据。主要研究内容和结论如下：
　　1.何首乌致肝毒性的现象客观存在，不规范使用是何首乌产生肝毒性的重要原因之一，市场流通的药材质量对何首乌肝毒性的发生也有一定的影响。
　　充分利用医院临床病例资料，结合何首乌肝损伤的文献报道，开展何首乌肝损伤的临床流行病学调查，深入调查分析何首乌产生肝毒性的客观原因，为阐释何首乌肝毒性的客观真实性及毒性特征提供基本的临床信息。主要结果显示：（1）何首乌致肝毒性的现象客观存在。（2）何首乌肝毒性存在特异质现象。（3）何首乌肝损害危险因素包括：何首乌本身存在可能会导致肝毒性成分，市场流通药材质量存在一定问题；另外民众过分夸大何首乌的功效，购买使用何首乌缺少监管；另外，处方中生首乌、制首乌书写不规范等也会影响何首乌临床合理应用。
　　为了加强何首乌合理用药的指导，减少肝毒性的发生，建议有关部门加强实施对何首乌正确使用的科普宣传和监管。
　　2.建立了基于临床标本和代谢组学技术的何首乌肝毒性诊断标志物研究方法和筛选模式，分析了何首乌致肝毒性的体内代谢通路变化，为何首乌的临床早期诊断和预后提供科学参考。
　　以何首乌肝损伤患者的血清为研究对象，采用LC- MS/MS Q-TOF技术表征临床何首乌肝毒性患者血清与正常人血清的代谢图谱差异，结合代谢组学分析手段，筛选了能准确评估何首乌致肝毒性引发代谢紊乱的特征标志物40个，代谢通路分析推测何首乌肝毒性可引发肝脏损伤和肝胆淤积，其机制可能与脂质过氧化有关，并发现1个与患者治疗转归过程相关的标志物四氢皮质酮，可望用于何首乌肝损伤患者的预后，且在典型患者和何首乌致肝损伤的大鼠中被验证，标志物的发现对科学评估何首乌肝毒性的客观真实性和早期辅助诊断提供临床有价值的参考。但由于病例数量的限制，该标志物的普适性和准确性还需要开展大样本量的前瞻性研究来进一步证实。
　　3.初步阐明了何首乌致肝损伤大鼠血清和胆汁中重要胆汁酸的变化规律，探讨了何首乌改变胆汁酸代谢及其与胆汁淤积型肝损伤的相关性。
　　何首乌在临床上引起的肝损伤部分表现为胆汁淤积的症状，为了探讨何首乌致胆汁淤积的内在规律，我们在大鼠上复制何首乌致肝损伤的模型，通过检测反应胆汁淤积的灵敏指标总胆汁酸（TBA）、总胆红素（TBIL）、碱性磷酸酶（ALP）等，判断肝损伤的基本类型与胆汁淤积的内在关系，结果显示生首乌组大鼠的TBA在血清和胆汁中的浓度都显著下降，在肝脏中显著升高；血清、胆汁中ALP和TBIL的变化情况在一定程度上表现了胆汁淤积的生化特征。生首乌致肝损伤大鼠血清和胆汁中TBA的含量降低，进一步采用质谱检测胆汁和血清中几种主要的胆汁酸含量，结果在血清和胆汁中大部分胆汁酸的含量呈降低趋势，特别在胆汁中除了 TCA，所检测的其他8种胆汁酸均呈下降趋势，胆汁酸的下降会影响胆汁对食物的消化，特别是对脂类物质，临床何首乌肝中毒的患者经常出现的食欲不振、厌油等症状是否与几种主要胆汁酸含量的降低有关，还需要进一步验证。
　　4.考察了何首乌及主要单体成分对体外培养的人正常肝细胞系L02细胞毒性作用，并明确了何首乌及主要单体成分对肝细胞凋亡的影响，在细胞水平上揭示其引起肝细胞毒性的主要机制。
　　给药24h后，何首乌、大黄素、大黄酸、没食子酸及三个单体联合给药组均出现Caspase-3和Bax表达量的提高，较对照组相比大黄素对Caspase-3和Bax表达量具有显著的促进作用，没食子酸作用最小；大黄酸组Caspase-9蛋白表达提高，其他实验组则出现表达下降的结果，其中大黄素对Caspase-9蛋白表达的下调作用最大，没食子酸和何首乌对Caspase-9的作用次之；何首乌组Bcl-2表达量下降，其他各实验组Bcl-2表达量均提高，大黄酸对Bcl-2的促进表达作用最强，大黄素较弱。何首乌及其主要成分与细胞凋亡信号通路Caspase通路有关，能调节Bcl-2和Bax两个凋亡相关蛋白的表达。本实验结果为解释何首乌引起肝毒性的类型及相关机制提供了分子水平的证据。除大黄素、大黄酸和没食子酸以外，何首乌中其他成分对人肝细胞的影响需进一步研究。
　　5.采用网络毒理学方法，基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络，筛选预测何首乌可能的肝毒性成分4个及其可能作用的酶靶点11个。
　　为了更深入全面认识何首乌产生肝毒性的内在规律及作用物质，我们借鉴网络药理学的研究思路和方法，在前期研究的基础上，通过构建―疾病-基因-靶点-药物‖相互作用网络的基础上，分析基因网络库、蛋白网络库、疾病网络库、药物网络库等现有数据库的信息资料，结合从前期实验中获得的谱图数据,利用专业网络分析软件及算法整体预测何首乌产生肝毒性的成分和毒性机制。结果预测出与何首乌肝毒性密切相关的成分4个，其中涉及11个主要的酶，何首乌的肝毒性机制可能是通过影响这些酶的变化产生的。预测出的何首乌毒性成分和可能的机制还需要进一步实验验证，验证工作本课题组正在进行。
　　6.根据本课题对何首乌肝毒性客观性的认识，提出何首乌合理用药建议。
　　何首乌导致患者肝损害的现象客观存在，肝胆系统损伤是其最重要和最主要的不良反应，少数患者发生严重肝损害，患者的总体预后较好。基于本课题研究发现，对何首乌临床合理用药提出以下建议：（1）生首乌不宜用于保健食品，制首乌慎用于保健食品；（2）何首乌使用中严格控制剂量和适应症；（3）取缔非法售药途径，避免劣质药材和饮片流入市场；（4）完善何首乌质量控制标准，增加生物毒价评控指标；（5）尽快发布何首乌肝毒性警示信息，提高群众安全意识。
　　综上所述，本研究针对何首乌的肝脏严重不良反应问题，采用临床病例标本、代谢组学、细胞毒理学及网络毒理学研究方法，用临床证据和实验数据证实了何首乌肝毒性的客观真实性，查实了盲目滥用和不规范使用是造成何首乌肝毒性产生较多的主要原因，筛选并鉴定了一些可用于何首乌肝毒性早期辅助临床诊断的生物标志物，提出了临床合理用药方案，以期减少何首乌肝损害的发生，避免患者不必要的身心和经济损失。同时，本研究基于临床标本和转化毒理学的中药毒副作用研究模式，对其他中药毒性客观评价和研究也有参考意义。

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第一章 绪 论

1. 中药―药物肝‖的临床现状与问题

2. 药源性肝损害诊断方法的研究现状及问题

3. 代谢组学在疾病诊断的应用及其优势

4. 何首乌不良反应的研究现状

5. 何首乌肝毒性研究的关键科学问题

6. 本课题研究思路与内容

7. 本研究的创新点和研究意义

第二章 何首乌肝毒性临床案例及影响因素分析

1. 何首乌肝毒性文献报道和医院数据库病例分析

2. 何首乌致肝毒性主要影响因素分析

3.小结与讨论

第三章 基于临床标本和代谢组学的何首乌肝毒性生物标志物筛查

1 实验材料

2 实验方法

3实验结果

4 小结与讨论

第四章 何首乌改变胆汁酸代谢及其与胆汁淤积型肝损伤的相关性研究

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4．小结和讨论

第五章 何首乌及其主要成分对人正常肝细胞凋亡的影响

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4．小结和讨论

第六章 何首乌肝毒性的网络毒理学分析

1. 数据与软件

2. 分析方法

3. 分析结果

4. 小结与讨论

第七章 结语与展望

1. 主要研究结果与结论

2.展望

参考文献

在读期间发表的学术论文

致谢

附发表文章

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