电针对荷瘤小鼠自发性活动昼夜节律时相特征的影响及其分子机制

摘要

目的：研究荷瘤小鼠自发性活动昼夜节律时相特征及电针干预对其节律的影响作用，并从电针对荷瘤小鼠视交叉上核（suprachiasmatic nucleus, SCN）核心生物钟基因及部分节律输出信号分子的影响探讨电针对荷瘤小鼠自发性活动昼夜节律影响作用的分子调控机制。
　　方法：（1）采用成都中医药大学时间生物学实验室自主研发的小动物自发活动自动记录及分析系统以及美国Clocklab生物节律数据采集分析系统对实验动物自发性活动昼夜节律进行监测和记录。将筛选出的14只 C57BL/6J小鼠随机分为空白组和模型组，每组7只动物。先将动物在光暗交替状态（LD）下驯化10天后关灯使动物处于暗置状态（DD）即自由运行状态，DD驯化10天后开始造模。（2）将MA-782小鼠乳腺癌细胞株接种于模型组小鼠左侧腋下复制荷瘤小鼠模型，造模成功后在自由运行状态下继续监测节律7天，通过造模前后的节律参数变化的分析研究自由运行状态下荷瘤动物自发性活动昼夜节律时相特征。（3）将重新筛选出的56只C57BL/6J小鼠随机分为空白组、模型组和6个时相点电针组（CT0电针组、CT4电针组、CT8电针组、CT12电针组、CT16电针组、CT20电针组），每组7只动物。动物LD驯化至造模过程同（1），造模方法同（2）。（4）造模成功后继续监测节律7天，第8天开始电针干预，选取“百会”和“长强”穴，频率2/15Hz，电流0.5mA，每次15分钟，每天电针1次，连续电针3天。电针操作结束后先自由运行两天以屏蔽掩蔽效应，然后继续监测节律10天，对电针前后的节律参数变化进行分析，研究6个不同时相点电针对荷瘤小鼠自发性活动昼夜节律的影响作用并筛选出电针效应的最佳时相点，以进行下一步实验。（5）将重新筛选出的36只C57BL/6J小鼠随机分为空白组、模型组和电针组，每组12只动物。动物LD驯化至造模过程同（1）和（2），电针时间选择CT16，电针方法同（4），第三次电针后2h处死动物取材保存待测。（6）采用实时荧光定量PCR法检测各组动物SCN内生物钟基因Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Clock、Bmal1以及瘤组织内生物钟基因Per1和Per2的相对表达量。采用 Elisa法检测各组动物 SCN、外周血清和瘤组织内 SCN输出信号分子TGFα和PK2水平。
　　结果：（1）造模前，各组动物自发性活动昼夜节律的周期、中值、振幅、相位和总活动度均无统计学差异（p＞0.05），其自发性活动表现出明显近似昼夜节律性。（2）造模后，模型组动物自发性活动昼夜节律振幅和总活动度降低且相位超前，造模前后振幅差值、总活动差值和相位移动值与空白组比较其差异均具有统计学意义（p﹤0.05），而造摸前后周期差值和中值差与空白组比较均无统计学差异（p＞0.05）。（3）电针后，电针组动物自发性活动昼夜节律降低的振幅提高，超前的相位滞后，电针前后振幅差值和相位移动值与模型组比较其差异均具有统计学意义（p﹤0.05），六个不同时相点中以CT16电针效应最为明显。而电针组动物电针前后周期差值、中值差值和总活动度差值与模型组比较其差异均无统计学意义（p＞0.05）。（4）造模后，模型组动物SCN内核心生物钟基因Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Clock和Bmal1的表达均具有下调趋势，但Per1mRNA、Per2mRNA、Per3mRMA、Cry1mRNA、Cry2mRNA、ClockmRNA和Bmal1mRNA相对表达量与空白组比较其差异均无统计学意义（p＞0.05）。电针后，电针组动物SCN内Per2和Cry1基因表达上调，Per2mRNA和Cry1mRNA相对表达量与模型组比较均具有统计学差异（p﹤0.05）；而Per1、Per3、Cry2、Clock和Bmal1基因表达均具有上调趋势，但Per1mRNA、Per3mRNA、Cry2mRNA、ClockmRNA和Bmal1mRNA相对表达量与模型组比较其差异均无统计学意义（p＞0.05）。（5）造模后，模型组动物瘤组织内Per1基因表达下调，Per1mRNA相对表达量与空白组比较其差异具有统计学意义（p﹤0.05）；模型组动物瘤组织内Per2基因表达明显下调，Per2mRNA相对表达量与空白组比较其差异具有显著统计学意义（p﹤0.01）。电针后，电针组动物瘤组织内Per1和Per2基因表达未见明显上调，Per1mRNA和Per2mRNA相对表达量与模型组比较其差异均无统计学意义（p＞0.05）。（6）造模后，模型组动物SCN内 TGFα水平较空白组有所增高，但与空白组比较其差异无统计学意义（p＞0.05）；造模组动物外周血清 TGFα水平较空白组明显增高，与空白组比较其差异具有统计学意义（p﹤0.05）；造模组动物瘤组织内TGFα水平较空白组明显增高，与空白组比较其差异具有统计学意义（p﹤0.05）。电针后，电针组动物SCN、外周血清和瘤组织内TGFα水平均无明显变化，与模型组比较其差异均无统计学意义（p＞0.05）。（7）造模后，模型组动物SCN、外周血清PK2水平明显降低，与空白组比较其差异具有统计学意义（p﹤0.05）；模型组动物瘤组织内PK2水平较空白组有所降低，但与空白组比较其差异均无统计学意义（p＞0.05）。电针组动物SCN和外周血清内PK2水平均明显增高，与模型组比较其差异均具有统计学意义（p﹤0.05）；电针组动物瘤组织内PK2水平较模型组有所增高，但与模型组比较其差异无统计学意义（p＞0.05）。
　　结论：C57BL/6J小鼠荷瘤后，其自发性活动昼夜节律具有一定程度的改变，其时相特征表现为振幅及总活动度降低、相位超前。自由运行状态下，电针可以在一定程度上恢复荷瘤小鼠自发性活动昼夜节律降低的振幅，并使超前的相位后移，但不能明显影响其节律的周期、中值及总活动度。电针效应具有明显的依时相性，6个不同时相点中以CT16电针效应最为明显。电针对荷瘤小鼠SCN内某些生物钟基因的上调作用以及对SCN节律输出信号分子PK2的调控作用可能是电针发挥其节律调整作用的分子机制之一。

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引言

实验研究

1.荷瘤小鼠自发性活动昼夜节律时相特征

2.电针对荷瘤小鼠自发性活动昼夜节律时相特征的影响及最佳时相点的筛选

3. 电针影响荷瘤小鼠自发性活动昼夜节律的分子机制

讨论

1. 祖国医学对生物节律和时间治疗学的认识

2. 模型的选择

3. 时相点及针刺穴位的选择

4. 自由运行状态下荷瘤小鼠自发性活动昼夜节律特征

5. 电针对荷瘤小鼠自发性活动昼夜节律的影响作用

6. 电针影响荷瘤小鼠自发性活动昼夜节律的分子机制探讨

结论

问题与展望

致谢

参考文献

附件

附件一 综述

附件二：在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果

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