红花查尔酮合成酶基因的表达及红花黄色素类成分积累的分析

摘要

红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花，是活血化瘀要药，可活血通经、散瘀止痛，用于经闭，痛经，恶露不行，癥瘕痞块等，大量应用于中成药生产和临床处方中，如《国家基本药品》目录中的血府逐瘀丸、乳癖消片、伤科接骨片、舒筋活血丸、颈舒颗粒等中成药都用到了红花。红花有效成分为红花黄色素类查尔酮成分。
　　本研究从红花黄酮类成分生物合成路径的第一个关键酶基因——查尔酮合成酶基因（chalcone synthase gene，chs）和红花黄色素类成分（saffloryellow，SY）入手，克隆、分析、表达了查尔酮合成酶基因，分析了红花黄色素类成分的积累规律，为红花黄色素类成分生物合成机制的研究奠定了基础。研究结果如下：
　　1.红花chs的克隆、生物信息学分析及表达
　　分别从红花花期（1d-7d）新鲜花冠中提取RNA，将质量和纯度合格的RNA反转录为cDNA，设计特异性引物，考察PCR条件，得到PCR产物，测序PCR产物序列，结果为：红花RNA提取的最佳方法是改良的Trizol法；PCR反应最佳特异性引物是： Forward-Primer： ATGGCATCCTTAACCGATATT，Reverse-Primer：TTAAGCGGCAATGGGGGT；最佳反应条件是：94℃，3 min，30 cycles（94℃，30 sec；64.2℃，30 sec；72℃，10 min），72℃，5 min；PCR产物序列全长为1149 bp，具有1041 bp的完整开放阅读框，编码346个氨基酸；NCBI上的Blastp比对发现，该蛋白属于CHS家族，比对结果显示红花CHS与100余种 NCBI上登录的植物有相似性，其中与菊科管状花亚科植物水飞蓟（Silybum marianum）、翠菊（Callistephus chinensis）、菊花（Dendranthema morifolium）、红凤菜（Gynura bicolor）、黑心金光菊（Rudbeckia hirta）、大丽花（Dahlia pinnata）的相似性分别达95％、95%、94%、94%、93%、92%。
　　对红花 chs进行生物信息学分析，结果为：MEGA5.1构建进化树显示红花CHS与水飞蓟CHS亲缘关系最近，两者同属经典植物分类学中的菊科管状花亚科菜蓟族；ProtParam预测红花CHS蛋白分子式为C1678H2693N451O493S20，分子量为37.7 kD，等电点为6.10，负电荷的氨基酸残基数（Asp+Glu）为42，正电荷的氨基酸残基数（Arg+Lys）为38，不稳定参数为39.39，属于稳定蛋白；Protscale预测编码氨基酸序列的疏水性图谱，整个肽链中最高疏水峰值2.218，最高亲水峰值为-2.164，亲水性氨基酸相对较为均匀的分布在整个肽链中，略多于疏水性氨基酸；Protscale预测红花CHS的二级结构显示约有142个α-螺旋，占45%，48个伸展片段，占14%，156个自由卷曲，占41%；Protscale对红花CHS的氨基酸序列进行蛋白质三维结构的同源性建模，获得了红花CHS氨基酸序列的预测三级结构。
　　通过对标准曲线、扩增曲线、溶解曲线的考察，建立了红花chs和管家基因25s的real-time PCR表达方法，得到了红花chs的相对表达量，从大到小依次为：3d（2.80）>6d（1.12）>2d（1.10）>7d（0.85）>5d（0.82）>1d（0.28）>4d（0.13）。红花chs的相对表达量呈现出四个阶段：1d-3d为快速上升期，3d相对表达量最高，高达2.8；3d-4d为拐点期，4d相对表达量最低，仅有0.13；4d-6d为缓慢上升期；6d-7d为衰减期。
　　2、红花羟基红花黄色素A的积累规律研究
　　HSYA为SY中含量最高的物质，也是红花主要的有效成分，研究HSYA积累规律，有助于分析SY积累规律。因此采用HPLC测定花期每天HSYA含量，测定结果为：3d（1.71%）>2d（1.53%）>4d（1.42%）>5d（1.14%）>6d（0.68%）>7d（0.66%）>1d（0.46%）。2d-5d均符合《中国药典》2010年版一部要求。从结果可以看出，HSYA积累呈现出先增后减的动态变化规律，其中3d最高，达1.71%，1d含量最低，仅为0.46%，样本2d-4d HSYA含量较高，但红花药用部位为开放的管状花，花期第二天开放的管状花数量较少，不宜采收，因此在花开第三天、第四天采收最佳。
　　3、红花HPLC指纹图谱研究
　　为更全面掌握SY积累规律，通过对检测波长、流动相考察，建立了红花HPLC指纹图谱色谱条件：色谱柱：ZORBAX SB-C18柱（4.6×250 mm，5μm）；流动相：A为乙腈，B为0.01％三氟乙酸溶液，梯度洗脱：0～10 min，2％～10％A；10~25 min，10％～15％A；25~45 min，l5％～20%A；45～65 min，20%～25％A；65~70 min，25%～2％A；检测波长：403 nm；柱温：25℃；流速：1 mL/min；进样量：20μL；采集花期1d-7d样本的指纹图谱；并建立了红花指纹图谱共有模式图。结果显示1d-7d样本有12个共有峰，相似度较高，在0.97以上，其中7号峰和10号峰峰面积较高，占总峰面积的80%左右。
　　采用LC-MS技术分析峰面积较大的7号峰及10号峰。7号峰在负离子模式下，其质荷比为611，碎片离子分别为491，403，325，207，鉴定其为羟基红花黄色素A（hydroxysaffloryellow A，HSYA，C27H32O16，分子量612）。10号峰在负离子模式下，其质荷比为1043，碎片离子分别为1025，923，593，449，287，鉴定其为脱水红花黄色素 B（anhydrosaffloryellow B，AHSYB，C48H52O26，分子量1044）。
　　红花指纹图谱总峰面积从大到小依次为：3d>2d>4d>5d>6d>1d>7d，呈现出1d-3d递增、3d-7d递减的趋势；HSYA和AHSYB峰面积从大到小依次为：3d>2d>4d>5d>6d>7d>1d，也呈现出1d-3d递增3d-7d递减的规律。
　　4、红花chs相对表达量与红花黄色素类成分积累量的关联性分析
　　分析红花chs相对表达量与SY积累量关联性分析发现：1d-3d为chs相对表达量的快速上升期，其快速上升至最高，SY积累量随之上升至最高；3d-4d为chs相对表达量的拐点期，其急剧下降到最低，SY积累量也随之降低，但幅度较小；4d-6d为chs相对表达量的缓慢上升期，SY积累量在该时期缓慢下降；6d-7d为 chs衰减期，SY积累量持平。由于植物次生代谢产物的合成是一个复杂的系统，该系统受环境因子、调控因子等多种因素的影响，呈现出前四天正相关，后三天相关性较弱的关联性。
　　本文成功克隆、分析及表达了红花查尔酮合成酶基因，得到了羟基红花黄色素A动态积累规律，建立红花HPLC指纹图谱，鉴定了脱水红花黄色素B，得到了红花黄色素类成分动态积累规律，并分析了chs表达量与红花黄色素类成分的关联性。

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第一章 引言

1.1 红花黄酮类成分研究进展

1.2 药用植物黄酮类化合物代谢合成途径及相关功能基因的研究进展

1.3 红花黄酮类化合物合成途径研究进展

1.4 小结

第二章 红花查尔酮合成酶基因的克隆、生物信息学分析及表达

2.1 材料、试剂与仪器

2.2 红花总RNA提取和逆转录实验

2.3 红花chs的克隆和生物信息学分析

2.4 红花chs的表达

2.5 小结

第三章 红花羟基红花黄色素A的积累规律研究

3.1 材料、试剂与仪器

3.2 对照品溶液的制备

3.3 供试品溶液的制备

3.4 色谱条件

3.5 方法学考察

3.6 羟基红花黄色素A含量测定结果

3.7 小结

第四章 红花HPLC指纹图谱研究

4.1 材料、试剂与仪器

4.2 对照品溶液的制备

4.3 供试品溶液的制备

4.4 色谱条件

4.5 方法学考察

4.6 红花指纹图谱分析

4.7 LC-MS分析

4.8红花黄色素类成分积累规律

4.9 红花chs的表达与红花黄色素类成分的关联性分析

4.10 小结

第五章 总结与展望

5.1 红花查尔酮合成酶基因的克隆、生物信息学分析及表达

5.2 红花羟基红花黄色素A的积累规律研究

5.3 红花HPLC指纹图谱的研究

5.4 思考与展望

参考文献

致谢

在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果

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