基于mGluRs探讨补肾活血法对AGEs及缺氧条件下视网膜神经兴奋性毒性损伤的干预机制

摘要

背景：糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）中存在谷氨酸（glutamate，Glu）兴奋性神经毒性损害，Glu既可作用于离子型Glu受体（ionotropic glutamate receptors，iGluRs）也可作用于代谢型Glu受体（metabotropic glutamate receptors，mGluRs）而发挥兴奋性神经毒性作用。其中，mGluRs的表达异常在其中可能起着重要的作用，但至今未见中医药对DR病理过程中视网膜Müller细胞和神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)的mGluRs表达有何影响的报道。
　　目的：从mGluRs角度探讨补肾活血法对糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）及缺氧条件下视网膜神经兴奋性毒性损伤的干预机制。
　　方法：采用中药血清学方法制备补肾活血中药含药血清。分别以改良消化方法纯化培养SD乳鼠视网膜Müller细胞并传代至第2代、两步法纯化培养SD乳鼠RGCs，然后将RGCs种入第2代Müller细胞生长的25cm2培养瓶中，二者比例大约为1:25，共培养5d后，将12个培养瓶随机分为正常对照组（20％正常SD大鼠血清培养）、正常中药干预组（20%SD大鼠含药血清培养）、低AGEs组（终浓度50mg/L的糖基化终末产物）、低AGEs中药血清干预组（终浓度50mg/L的糖基化终末产物+20%SD大鼠含药血清干预）、高AGEs组（终浓度100mg/L的糖基化终末产物培养）、高AGEs中药血清干预组（终浓度100mg/L的糖基化终末产物+20%SD大鼠含药血清干预）、低缺氧组（终浓度1.0 mmol/L连二亚硫酸钠培养）、低缺氧中药血清干预组（终浓度1.0 mmol/L连二亚硫酸钠+20%SD大鼠含药血清干预）、高缺氧组（终浓度2.0mmol/L的连二亚硫酸钠培养）、高缺氧中药血清干预组（终浓度2.0mmol/L的连二亚硫酸钠+20%SD大鼠含药血清干预）、高AGEs+低缺氧组（终浓度100mg/L的糖基化终末产物+终浓度1.0mmol/L的连二亚硫酸钠）、高AGEs+低缺氧中药血清干预组（终浓度100mg/L的糖基化终末产物+终浓度1.0mmol/L的连二亚硫酸钠+20%SD大鼠含药血清干预）。采用Western blot蛋白印迹法检测各组mGluRs亚型以及Homer的蛋白水平表达水平，以酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)测定各组细胞上清液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH)含量。
　　结果：⑴AGEs或/和缺氧干预组与正常组比较：低AGEs组 mGluR1、mGluR5和mGluR4均较正常组明显升高（P<0.05），mGluR2/3、mGluR7及Homer蛋白表达与正常组之间的差异均无统计学意义(P>0.05）；高AGEs组 mGluR1、mGluR5和mGluR4表达均较正常组明显增强（P<0.05）；mGluR7表达较正常组明显降低（P<0.05），mGluR2/3和Homer蛋白表达与正常对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)；低缺氧组mGluR1、mGlu5、mGluR4表达均较正常组明显增强（P<0.05），mGluR2/3和mGluR7表达比正常组明显降低（P<0.05），Homer蛋白表达与正常对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）；高缺氧组 mGluR1、mGlu5、mGluR4表达较正常组明显增强（P<0.05），Homer、mGluR2/3表达均较正常对照组明显降低（P<0.05）；mGluR7表达与正常对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）；低AGEs+低缺氧组以及高AGEs+低缺氧组 Homer、mGluR1、mGluR5、mGluR2/3、mGluR4和mGluR7表达均较正常组明显升高（P<0.05）。⑵AGEs组或/和缺氧干预组间的比较：高AGEs组与低AGEs组比较：高AGEs组的mGluR1表达较低AGEs组明显升高（P<0.05），高AGEs组Homer、mGluR5、mGluR7表达较低AGEs组均明显降低（P<0.05)；高AGEs组mGluR2/3、mGluR4表达与低AGEs组比较差异均无统计学意义（P>0.05）；低缺氧组与高缺氧组比较，高缺氧组Homer及mGluR2/3表达较低缺氧组明显降低(P<0.05)，mGluR1、mGluR4、mGluR7蛋白表达较低缺氧组均明显增加（P<0.05），mGluR5表达与低缺氧组比较差异无统计学意义（P>0.05）；低缺氧组与低AGEs组比较，低AGEs组Homer蛋白和mGluR4以及mGluR5表达与低缺氧组比较差异无统计学意义（P>0.05），低AGEs组mGluR1、mGluR2/3、mGluR7蛋白表达较低缺氧组明显增加（P<0.05）；高AGEs与高缺氧组比较：高缺氧组 Homer、mGluR1、mGluR2/3表达均较高AGEs组明显下降（P<0.05），高缺氧组mGluR4、mGluR7表达均较高 AGEs组明显升高（P<0.05），高缺氧组 mGluR5表达与高AGEs比较差异无统计学意义（P>0.05）；低缺氧组与低AGEs+低缺氧组比较：低AGEs+低缺氧组Homer、mGluR1、mGluR5、mGluR2/3、mGluR4和mGluR7表达均比低缺氧组明显升高（P<0.05）；低缺氧组与高 AGEs+低缺氧组比较：高AGEs+低缺氧组Homer、mGluR1、mGluR5、mGluR2/3、mGluR4和mGluR7表达均比低缺氧组明显升高（P<0.05）；低AGEs组与低 AGEs+低缺氧组比较：低AGEs+低缺氧组Homer、mGluR1、mGluR5、mGluR4和mGluR7表达均比低AGEs组升高（P<0.05），低AGEs+低缺氧组mGluR2/3表达与低AGEs组比较差异无统计学意义(P>0.05)；高AGEs与高AGEs+低缺氧组比较：高AGEs+低缺氧组Homer、mGluR1、mGluR5、mGluR2/3、mGluR4和mGluR7表达均比高AGEs组明显升高（P<0.05）。⑶正常中药干预组与正常组比较：正常中药干预组 mGluR1蛋白表达明显增强（P<0.05），而Homer蛋白表达明显减弱（P<0.05），两组间mGluR各其余亚型的蛋白表达量以及LDH释放量相比较，其差异无统计学意义（P>0.05）。⑷AGEs或/和缺氧干预组与对应各中药干预组的比较：低AGEs组与低 AGEs中药干预组比较，低 AGEs中药干预组 mGluR5、mGluR4的表达较低AGEs组明显减少（P<0.05），mGluR1表达较低AGEs组明显升高（P<0.05），Homer、mGluR2/3及mGluR7表达两组之间比较，其差异均无统计学意义（P>0.05）；高AGEs中药干预组与高AGEs比较，高AGEs组中药干预组mGluR1较高AGEs组明显降低（P<0.05），mGluR4、mGluR7表达较高AGEs组明显升高（P<0.05），mGluR5、Homer、mGluR2/3表达两组之间比较，其差异均无统计学意义（P>0.05）；低缺氧组与低缺氧组中药干预组比较，低缺氧中药干预组mGluR1、mGluR4、mGluR5、mGluR7表达较低缺氧组均明显升高（P<0.05），Homer和mGluR2/3较低缺氧组均明显降低（P<0.05）；高缺氧组与高缺氧中药干预组比较，高缺氧中药干预组Homer、mGluR5、mGluR2/3、mGluR4、mGluR7蛋白表达较高缺氧组明显增加（P<0.05），mGluR1表达两组之间比较差异无统计学意义（P>0.05）；低AGEs+低缺氧组与低AGEs+低缺氧组中药干预组比较，低AGEs+低缺氧药干预组 Homer、mGluR1、mGluR5、mGluR2/3、mGluR4、mGluR7表达较低AGEs+低缺氧组均明显升高（P<0.05）；高AGEs+低缺氧组与高AGEs+低缺氧组中药干预组比较，高AGEs+低缺氧中药干预组mGluR2/3、mGluR4、mGluR7表达较高 AGEs+低缺氧组均明显升高（P<0.05），Homer、mGluR1、mGluR5两组之间比较，其差异无统计学意义（P>0.05）。⑸LDH结果：与正常组比较，低AGEs组、高AGEs、高缺氧组、低缺氧+低AGEs组、低缺氧+高AGEs组LDH释放量均较正常组明显增加（P<0.05）；正常中药干预组、低缺氧组的 LDH释放量与正常组比较，其差异均无统计学意义（P>0.05）；缺氧或/和AGEs干预组与其对应各中药干预组间比较，只有低AGEs中药干预组与低AGEs组的LDH释放量之间无明显差异（P>0.05），其余各中药干预组LDH释放量均明显减少（P<0.05）。⑹相关性分析结果：缺氧和/或AGEs干预条件下，LDH释放量的升高与mGluR1、mGluR5、mGluR4、mGluR7表达呈明显正相关(r=0.659、0.526、0.546、0.506，P<0.05）；而各中药干预组LDH与mGluR1、mGlu5、mGluR2/3、mGluR4、mGluR7均无明显相关性（r=0.106、0.131、0.001、0.240、0.144，P>0.05）；缺氧或/和AGEs干预条件下，Homer与mGluR1、mGluR5呈中度正相关（r=0.642、0.665，P<0.05）；而各中药干预组Homer与mGluR1、mGluR5均为中高度正相关（r=0.808、0.775，P<0.05）；缺氧或/和AGEs干预条件下，mGluR1与mGluR5呈高度正相关（r=0.804，P<0.05）；而各中药干预组mGluR1与mGluR5均为中高度正相关（r=0.613，P<0.05）；缺氧或/和AGEs干预条件下以及各中药干预组mGluR4与 mGluR7均为中度正相关（r=0.520、0.591，P<0.05）；缺氧或/和AGEs干预条件下，mGluR4与mGluR5呈明显正相关(r=0.708，P<0.05)；而各中药干预组 mGluR4和mGluR5的表达呈明显正相关、且相关系数增加(r=0.912，P<0.05)。
　　结论：①采用细胞免疫组化法和Western blot蛋白印迹法揭示了在体外共同培养的视网膜Müller细胞与RGCs条件下存在第Ⅰ组mGluRs（mGluR1、mGluR5），第Ⅱ组mGluRs（mGluR2/3）及第Ⅲ组mGluRs（mGluR4、mGluR7）蛋白的表达。②AGEs可导致体外共同培养的视网膜 Müller细胞和RGCs的mGluRs和Homer表达出现不同程度的改变，并且其改变程度及方式与剂量存在相关性：在50mg/L和100mg/L的AGEs条件下，mGluR5表达均明显升高，提示视网膜Müller细胞和RGCs出现明显的神经兴奋性毒性损伤；同时细胞出现mGluR1、mGluR4升高的代偿性保护反应；但高AGEs组mGluR7和Homer蛋白比低AGEs组明显降低，揭示mGluR7和Homer可能更易受到AGEs损伤。③不同缺氧条件均可导致体外共同培养的视网膜Müller细胞和RGCs的 mGluR5表达量明显升高，出现兴奋性神经毒性损伤；同时细胞出现mGluR1、mGluR4升高的代偿性保护反应；但mGluR2/3可能对缺氧的耐受性比mGluR1和mGluR4低，更易受到缺氧损伤。④缺氧与AGEs同时干预可导致共同培养的视网膜Müller细胞和RGCs释放大量的Glu，所造成的神经兴奋性毒性作用比单纯的缺氧或单纯的AGEs更明显；在高浓度Glu的刺激下，视网膜Müller细胞和RGCs的mGluR1、mGluR4、mGluR7、mGluR2/3均出现不同程度升高的代偿性保护反应，试图通过负反馈机制抑制Glu的进一步释放。⑤补肾活血中药复方含药血清可降低本实验中缺氧、AGEs以及AGEs+缺氧不同干预条件下细胞神经兴奋性毒性损伤。但在高缺氧以及缺氧/AGEs条件下，其干预途径主要在于增强第Ⅱ组 mGluRs（mGluR2/3）和第Ⅲ组的 mGluR4和mGluR7表达，启动负反馈机制、减少突触前膜释放Glu的保护性反应，从而抑制神经兴奋性毒性作用；在单纯低AGEs干预下，其干预途径主要在于直接降低mGluR5表达，增高mGluR1表达以减轻Glu的释放；在高浓度AGEs干预时，其干预途径主要在于增强第Ⅲ组的mGluR4和mGluR7表达来减轻细胞损害。⑥AGEs或/和缺氧条件下，视网膜Müller细胞与RGCs细胞膜稳定性下降是导致mGluR1、mGluR5、mGluR4、mGluR7的表达升高的主要原因之一；而补肾活血中药能明显提高共同培养细胞在病理条件下细胞膜的稳定性。⑦补肾活血中药可能是通过增加 Homer蛋白与第Ⅰ组 mGluRs（mGluR1和mGluR5)的连接作用而发挥下级连级信号通路调节功能。⑧补肾活血中药能提高mGluR4的反应敏感性以对抗mGluR5的升高所造成的细胞神经兴奋性毒性损害。

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略缩词

1.引言

2 正文第一部分 视网膜Müller 细胞和RGCs培养与鉴定

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

3.正文第二部分 体外共培养的RGCs与视网膜Müller细胞的mGluRs的表达情况

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

4 正文第三部分 基于mGluRs探讨补肾活血法对AGEs及缺氧条件下视网膜神经兴奋性毒性损伤的干预机制

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 统计分析方法

4.4 结果与分析

4.5 讨论

4.6 结论

问题与展望

致谢

参考文献

综述:代谢型谷氨酸受体与糖尿病性视网膜病变

在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果

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