KIR、HLA-Cw基因分型分析及HCV体外感染人CD4+T细胞靶细胞模型的建立的研究

摘要

目的：本次研究主要完成了1.对40例健康汉族人群KIR、HLA-Cw位点基因分型，分析并分选出KIR2DL3+/HLA-C1+个体；2.建立HCV体外感染人CD4+T细胞靶细胞模型。本次研究的两部分内容为KIR2DL3/HLA-C1基因组合与NK细胞体外抑制HCV复制相关性研究的关键前提和基础。
　　方法：⑴取随机抽取的40例健康汉族人群外周血样本，采用商用试剂盒严格按照说明书进行KIR、HLA-Cw位点的基因分型；采用直接计数法对分型结果进行综合分析。⑵采用脂质体转染法进行HCVRNA对Huh-7.5细胞的转染，RT-PCR检测转染后细胞内HCVRNA复制情况；Western blot检测转染后细胞内HCV NS3、NS5A蛋白的表达情况；免疫荧光法检测转染后细胞内NS5A蛋白的细胞定位。检测成功后，收集产生自上述HCV Huh-7.5细胞体外培养系统的HCV病毒颗粒，与分离自抗HCV阴性个体的CD4+T细胞共同孵育，RT-PCR检测共孵育后CD4+T细胞内HCVRNA复制情况；Western blot检测共孵育后CD4+T细胞内HCV NS3、NS5A蛋白的表达情况。
　　结果：①40例样本中HLA-Cw位点HLA-C1基因出现频率较HLA-C2高，且HLA-C1C1出现的频率较HLA-C1C2高；KIR基因型中，以3DL1、2DL1、2DL3、2DL4、3DL2、3DL3、2DP1、3DP1、2DS4出现频率较高，而3DS1、2DS1、2DS2、2DS3、2DS5、2DL2、2DL5出现频率较低；KIR2DL3+/HLA-C1C1例数较KIR2DL2+/HLA-C1C1多。以上可见，KIR2DL3+/HLA-C1+基因型组合以KIR2DL3-2DL3/HLA-C1C1者较多，占总样本数52.5％。②在HCV Huh-7.5细胞体外培养系统的构建中，RT-PCR检测到转染后Huh-7.5细胞内HCVRNA的复制；Western blot检测转染后Huh-7.5细胞内HCV NS3及NS5A蛋白的表达；免疫荧光法对转染后细胞内HCV NS5A蛋白成功进行了定位。产生自HCV Huh-7.5细胞体外培养系统的HCV病毒颗粒与CD4+T细胞共同孵育，RT-PCR及Western blot技术分别检测到共孵育后CD4+T细胞内HCVRNA的复制及HCV NS3及NS5A蛋白的表达。
　　结论：⑴根据KIR、HLA-Cw分型结果进行分析，我们得到KIR2D L3+/HLA-C1+(KIR2DL3-2DL3/HLA-C1C1、KIR2DL3-2DL2/HLA-C1C1）、—/HLA-C1+(KIR2DL2-2DL2/HLA-C1C1)、KIR2DL3+/—(KIR2DL3-2DL2/C2-)4种基因组合个体。⑵成功建立了HCV(J6/JFH) Huh-7.5细胞体外培养系统，并产生具有感染作用的HCV病毒颗粒；利用上述病毒颗粒在体外成功进行了对人CD4+T细胞的感染，建立了HCV体外感染人CD4+T细胞靶细胞模型。

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缩 略 语 表

引言

第一部分

材料方法

样本及材料

方法

统计学处理

结果

1 40例样本HLA-Cw位点分型结果及等位基因检测结果

2 40例样本KIR分型结果及不同角度分析

3 40例样本中HLA-C1及KIR2DL3、KIR2DL2基因组合及其等位基因组合分析

讨论

第二部分

材料方法

材料

方法

结果

1 质粒的提取、保存与鉴定

2 HCVRNA的转录、纯化制备

3 HCV RNA对Huh-7.5细胞株的转染

4 HCV对人CD4+ T细胞的体外感染

讨论

结论

问题与展望

致谢

参考文献

附录

附录一 综述:丙型肝炎病毒转染模型研究进展

附录二：在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果

附录三：受试者知情同意书

附录四：申明及授权书